五花血藤提取物對大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中凋亡相關(guān)因子表達的影響△

楊丹 余德立 孫寶飛 康朝勝 孫江齡 余資江

視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)是視網(wǎng)膜在缺血損傷的基礎(chǔ)上，恢復(fù)血流灌注后并不緩解視網(wǎng)膜細胞的損傷，反而加劇了細胞的死亡使損傷更嚴重的現(xiàn)象。近年來，RIRI已成為臨床上廣泛關(guān)注的問題[1]。RIRI的機制十分復(fù)雜，包括氧自由基學(xué)說、一氧化氮學(xué)說、鈣通道學(xué)說、炎癥反應(yīng)學(xué)說、興奮性氨基酸學(xué)說、基因調(diào)控學(xué)說和細胞凋亡學(xué)說等[2-3]，而細胞凋亡學(xué)說近幾年成為研究的重點[4-7]。目前研究發(fā)現(xiàn)，RIRI中存在著神經(jīng)細胞凋亡現(xiàn)象，且凋亡是視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞丟失的重要因素之一[8-9]。細胞凋亡過程受到多種基因調(diào)控，主要有Bcl-2家族、Fas家族、Caspase家族和p53基因等[10]。五花血藤又名大血藤、紅藤等，系木通科植物五花血藤的莖。研究表明，五花血藤提取物沒食子酸(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)可以通過阻斷一氧化氮合酶的產(chǎn)生對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞起到保護作用，進而對RIRI起到治療作用[11]。而我們前期的研究結(jié)果也表明，五花血藤提取物(sargentodoxa cuneata extracts,SCE)可促進RIRI后神經(jīng)節(jié)細胞中超微結(jié)構(gòu)的恢復(fù)，并能激活抗細胞凋亡因子survivin從而起到一定的抑制凋亡的作用[12]，但是其具體的抗凋亡機制還不是十分明確。因此，本研究通過采用SCE實驗性防治大鼠 RIRI，觀察其對RIRI后凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白的表達影響，進一步闡明SCE對RIRI的保護作用及其可能的抗凋亡機制，以期為臨床應(yīng)用該藥治療視網(wǎng)膜缺血性疾病提供藥理學(xué)實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組選取健康清潔級成年SD大鼠90只，體質(zhì)量180～250 g，雌雄不限，由貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[合格證號：SCXK(黔)(2002-0001)]。隨機分為對照組、RIRI組與SCE組。其中SCE組于造模前3 d給予SCE灌胃，每天2次(劑量為10 g·kg-1·d-1)，灌胃持續(xù)到取材當日。對照組與RIRI組灌服相同劑量的生理鹽水。

1.2 五花血藤提取物的制備采取乙醇攪拌回流提取方法[13]，過濾之后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮液預(yù)凍后凍干。每次取提取物適量，用蒸餾水制備成含生藥1 g·mL-1的藥液，無菌密封后置入4 ℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要儀器與試劑LEICA RM2016 轉(zhuǎn)輪切片機(上海萊卡儀器有限公司)，OLYMPUS BH-2 顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，精密電子天平(德國Sartorius公司)。五花血藤(貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房)，妥布霉素滴眼液(美國愛爾康公司)，鹽酸丙美卡因滴眼液(比利時s.a.Alcon-Couvreur n.v.公司)，兔SP檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司)，兔抗Bcl-2 (c21)、兔抗Bax (p-19)、兔抗Caspase-3 (p11)抗體及多聚賴氨酸(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.4 大鼠RIRI模型的建立利用升高眼壓法來制造大鼠RIRI模型[14]。大鼠稱體質(zhì)量后給予10 g·L-1戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉。將大鼠側(cè)臥位固定于實驗臺上，選取右側(cè)眼球，滴加鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉后，將一端連有生理鹽水注射液的5號頭皮針從大鼠顳側(cè)角膜緣斜刺入眼前房，固定針頭并打開注射器。使輸液瓶與眼球垂直距離為150 cm，眼壓升高至110 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)，這時可見大鼠瞳孔散大，鞏膜變白。持續(xù)60 min后，拔出針頭，可見大鼠球結(jié)膜及鞏膜顏色迅速恢復(fù)正常，檢眼鏡下視網(wǎng)膜血供恢復(fù)，瞳孔回縮。術(shù)中及術(shù)后間斷滴加妥布霉素滴眼液防止角膜干燥及預(yù)防感染。

1.5 大鼠標本的制作RIRI組和SCE組分別于RIRI后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，對照組于相應(yīng)時間點過量麻醉大鼠后給予心臟灌注40 g·L-1多聚甲醛溶液處死大鼠各6只，立即取出眼球，經(jīng)Bouin液于4 ℃冰箱中固定24 h。從冰箱中取出標本后用流水沖洗24 h，之后再由蒸餾水浸泡三次，每次10 min。取出后放于干凈濾紙上用眼科剪去掉角膜(保留晶狀體以保持其形態(tài))，修剪平整后放入體積分數(shù)75% 酒精中過夜，隨后梯度脫水、石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度為5 μm。

1.6 大鼠視網(wǎng)膜Nissl染色從恒溫箱中取出處理好的切片立即放入二甲苯中透明兩次，每次 5 min。梯度酒精脫水(體積分數(shù)100%酒精5 min、體積分數(shù)95%酒精5 min)，然后立即用蒸餾水清洗。待切片晾干后進行焦油紫染色3 min，蒸餾水清洗2次，體積分數(shù)70%酒精(即刻)，經(jīng)觀察后放入二甲苯中3 min，中性樹脂封片，顯微鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.7 大鼠視網(wǎng)膜免疫組織化學(xué)染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-peroxidase,SP)免疫組織化學(xué)法檢測大鼠視網(wǎng)膜中Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白的表達。具體方法如下：將切片常規(guī)脫蠟至水，甲酸抗原修復(fù)5 min，體積分數(shù)3% H2O2去離子水孵育10 min滅活內(nèi)源性酶，滴加山羊血清封閉液，室溫15 min，加入一抗(1100)4 ℃冰箱中過夜。取出室溫靜置30 min復(fù)溫，滴加生物素化二抗，37 ℃恒溫箱中放置40 min。DAB 顯色，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。其中對照組一抗采用0.01 mmol·L-1PBS代替。

2 結(jié)果

2.1 大鼠視網(wǎng)膜Nissl染色結(jié)果對照組中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells,RGC)內(nèi)Nissl小體豐富，染色較深，呈塊狀分布;RIRI組中RGC內(nèi)Nissl小體減少，染色淺且分布不均;SCE組染色情況較RIRI組有所改善(見圖1)。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜Nissl染色結(jié)果(×200)

2.2 大鼠視網(wǎng)膜免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Bcl-2蛋白的陽性表達為黃色或棕黃色顆粒，主要在細胞漿中表達。Bcl-2蛋白在對照組視網(wǎng)膜中幾乎不表達，在6 h、12 h的RIRI組中陽性表達持續(xù)升高，24 h時表達開始增強，48 h時達到高峰。SCE組Bcl-2蛋白表達隨時間延續(xù)而增多，陽性細胞染色較深，但在各個時間點上陽性表達均多于RIRI組。兩組各時間點比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(見表1、圖2A和圖3)。

Bax蛋白的陽性表達為黃色或棕黃色顆粒，主要在細胞漿中表達。Bax蛋白在對照組略有表達，但不明顯，在6 h時的RIRI組中視網(wǎng)膜組織可見陽性表達，主要表現(xiàn)在神經(jīng)節(jié)細胞層(ganglion cell layer,GCL)和神經(jīng)纖維層(nerve fiber layer,NFL)，12 h時陽性表達持續(xù)增多，24 h時表達達到高峰，主要表達于GCL、NFL、內(nèi)核層及內(nèi)叢狀層，48 h時表達減少，72 h時仍有表達延續(xù)。SCE組Bax蛋白在各個時間點上陽性表達均低于RIRI組，細胞漿染色較淺，每高倍視野陽性細胞表達均較RIRI組有所下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(見表2、圖2B和圖4)。

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2蛋白表達結(jié)果

Caspase-3蛋白的陽性表達為黃色或棕黃色顆粒，主要在細胞核中表達。對照組幾乎不表達，在 6 h 時的RIRI組中表達有所上升，12 h時表達達到高峰，48 h時陽性表達下降，72 h時仍可見少量表達。SCE組Caspase-3蛋白的陽性表達在各個時間點上均低于RIRI組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(見表3、圖2C和圖5)。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜Bax蛋白表達結(jié)果

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜Caspase-3蛋白表達結(jié)果

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達趨勢圖

圖3 各組大鼠視網(wǎng)膜中Bcl-2蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×200)

圖4 各組大鼠視網(wǎng)膜中Bax蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×200)

圖5 各組大鼠視網(wǎng)膜中Caspase-3蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×200)

3 討論

RIRI的機制復(fù)雜，近年來國內(nèi)外研究進一步證明細胞凋亡與RIRI密切相關(guān)。細胞凋亡不是被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控等作用[15]。其中Bcl-2家族基因在細胞凋亡中起到重要作用，Bcl-2是一原癌基因，通過編碼Bcl-2蛋白發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用[16]。Bax是Bcl-2家族中的一員，發(fā)揮促凋亡作用，Bcl-2和Bax通過自身組成同二聚體和彼此之間組成異二聚體的不同比例介導(dǎo)其對細胞存活的生物學(xué)效應(yīng)[7,17]，并通過調(diào)控線粒體外膜通透性，控制體內(nèi)凋亡基因和細胞色素C等的釋放從而調(diào)控細胞是否存活[18]。在本實驗中，Bax蛋白在RIRI后6 h時開始表達，12 h時各層表達明顯增加，24 h時表達達到高峰，48 h時表達減弱，72 h時仍可檢測到Bax蛋白的表達。而Bcl-2蛋白隨再灌注時間的延長，表達量持續(xù)增高，于48 h時達高峰，72 h時表達出現(xiàn)下降。從實驗數(shù)據(jù)我們可以看出，RIRI組 6 h、12 h 時的Bcl-2/Bax比例上升，這與Bcl-2蛋白持續(xù)升高，自身形成二聚體有關(guān)。隨后24 h、48 h、72 h時的 Bcl-2/Bax比例是降低的，這時雖然Bcl-2蛋白持續(xù)升高，并達到高峰，但Bax蛋白的表達量在該時間點也達到一定高度，并維持較高水平，隨著時間的推移，促凋亡因素占主導(dǎo)作用，Bcl-2蛋白雖然可以通過阻止或降解細胞皺縮、染色質(zhì)濃縮和DNA裂解的發(fā)生來緩解視網(wǎng)膜細胞的凋亡，但依舊無法阻止細胞凋亡的趨勢。因此在RIRI組72 h時，我們可以看到損傷繼續(xù)發(fā)展，RGC計數(shù)下降，NFL明顯變薄，內(nèi)核層細胞明顯減少，部分結(jié)構(gòu)不清晰等現(xiàn)象。研究表明，Bcl-2作用于Caspase-3的上游，通過抑制Caspase-3而發(fā)揮抗凋亡作用。Bcl-2又是Caspase-3的底物，Caspase-3特異性降解后，其功能由抑制凋亡轉(zhuǎn)為觸發(fā)凋亡[19]。從結(jié)果中我們可以看到，Caspase-3的激活并表達的高峰出現(xiàn)在RIRI的早期，隨著再灌注時間的延長，Bcl-2可通過下調(diào)Caspase-3的表達來發(fā)揮抗凋亡作用。

五花血藤是我國的傳統(tǒng)中藥，多分布于西南地區(qū)。在近幾十年的臨床運用中，五花血藤主要與其他中草藥配伍，用于治療盆腔炎、子宮內(nèi)膜異位癥、闌尾膿腫等。研究發(fā)現(xiàn)，SCE中多糖組分(PSC)A-1和PSCB-1可通過下調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶水平，顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞一氧化氮的釋放，從而提高血清和肝臟超氧化物歧化酶活性來發(fā)揮抗炎作用[20]。研究還發(fā)現(xiàn)，SCE能改善局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中炎癥的反應(yīng)，其機制可能是通過抑制凋亡途徑增加營養(yǎng)因子對神經(jīng)元的保護，減少神經(jīng)細胞凋亡，激活腦細胞的自我保護從而改善海馬和皮質(zhì)區(qū)的組織病理學(xué)改變，減輕腦缺血再灌注損傷[21]。還有研究表明，SCE可以下調(diào)Bcl-2和Mcl-1的同時上調(diào)Bax的表達來發(fā)揮抗凋亡作用，從而在HepG-2移植瘤中抑制腫瘤細胞的生長而起到抗癌效果，并對正常組織細胞沒有明顯的毒副作用[22]。鑒于SCE的上述作用，我們在實驗中嘗試性的運用該藥來探索其對RIRI的機制，發(fā)現(xiàn)在RIRI的急性期給予SCE可在損傷早期通過上調(diào) Bcl-2 蛋白、下調(diào)Bax及Caspase-3蛋白的表達來發(fā)揮其抗凋亡作用。

綜上所述，我們初步判斷SCE對于大鼠RIRI有一定的治療效果，能緩解RIRI后造成的神經(jīng)細胞水腫等癥狀，同時激活抗細胞凋亡因子而起到一定的抑制凋亡的作用。本實驗對于貴州傳統(tǒng)中藥的開發(fā)和利用提供了一定的藥理學(xué)基礎(chǔ)。