那可丁聯(lián)合奧沙利鉑對人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞增殖及凋亡的影響

翟江云，張斌，郭佳維

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1.口腔頜面外科；2.眼科，遼寧 錦州 121000）

人舌鱗狀細(xì)胞癌是口腔中最常見的上皮源性腫瘤，約占25%～40%[1]。人舌鱗狀細(xì)胞癌具有明顯的侵襲性生物學(xué)行為，淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率高，有較高的發(fā)病率以及病死率，患者5年生存率＜50%[2-4]。含鉑方案的聯(lián)合化療是治療舌癌的重要方法之一，奧沙利鉑是第3 代鉑類抗腫瘤藥物，具有一定程度的細(xì)胞毒性[5]。那可丁是一種鄰苯二甲酸異喹啉生物堿，源自罌粟，結(jié)構(gòu)與秋水仙堿相似，長期以來被用作人類的咳嗽抑制劑[6]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)那可丁對各種腫瘤的生長均有抑制作用，且?guī)缀鯚o毒副作用，因此越來越多的人意識到其可作為抗癌藥物的潛力[7-8]。目前關(guān)于那可丁聯(lián)合化療藥物作用于人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113 細(xì)胞的基礎(chǔ)研究較少，本實驗擬初步探討那可丁聯(lián)合奧沙利鉑是否對人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113 細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同抑制作用，以期提高化療對細(xì)胞癌的抑制效果，并減輕毒副反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑

人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113 細(xì)胞（上海拜力生物科技有限公司），那可丁（北京百奧萊博科技有限公司）濃度：99.9%，溶于二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）。奧沙利鉑（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）濃度≥98%，溶于5%葡萄糖溶液。DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國HyClone 有限公司），胎牛血清（杭州四季青有限公司），青鏈霉素、DMSO（北京索萊寶科技有限公司），CCK-8 檢測試劑盒（上海弗元生物科技有限公司），Hoechst33342（沈陽萬類生物科技有限公司），Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（上海貝博生物有限公司），兔抗人Bax、Bcl-2、PARP、Cleaved Caspase-9 和Cleaved Caspase-3 多克隆抗體、兔抗人β-actin 單克隆抗體及HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG（沈陽萬類生物科技有限公司）。

1.2 分組

實驗分為空白對照組、奧沙利鉑組、那可丁組及聯(lián)合用藥組。空白對照組采用DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；奧沙利鉑組采用終濃度為2μmol/L 奧沙利鉑的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞[9]；那可丁組采用終濃度為40μmol/L 那可丁的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；聯(lián)合用藥組采用終濃度為2μmol/L 奧沙利鉑和40μmol/L 那可丁的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。

1.3 方法

人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113 細(xì)胞在含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置于37℃、5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化法傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3.1 CCK-8 法Tca8113 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化法制成單細(xì)胞懸液，對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。以5×103個/孔的細(xì)胞密度接種至96 孔板，每組分4 個平行孔，設(shè)置空白調(diào)零孔，每孔100μl，96 孔板的邊緣孔加入等量無菌PBS。將96 孔板置于含37℃、5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入含0、5、10、20、40、60 及80μmol/L 的那可丁培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入10μl CCK-8 試劑，放入培養(yǎng)箱孵育1 h，酶標(biāo)儀在450 nm 波長處測定吸光度（OD）值，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（OD藥物組-OD調(diào)零組）/（OD空白組-OD調(diào)零組）×100%[10]。

1.3.2 Hoechst33342 熒光染色法將Tca8113 細(xì)胞以5×104個/孔的細(xì)胞密度接種至24 孔板中，每孔1 ml。待細(xì)胞貼壁后，按照實驗分組加藥，處理細(xì)胞24 h 后每孔加入200μl Hoechst33342 染色液均勻覆蓋皿底，避光染色20 min，PBS 清洗3 遍，置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并隨機(jī)拍照記錄，實驗重復(fù)3 次。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)取對數(shù)生長期的Tca8113 細(xì)胞以5×105個/孔的細(xì)胞密度接種至6 孔板中，按實驗分組處理細(xì)胞24 h，胰酶（不含酚紅、EDTA）消化，PBS清洗3遍，加入400μl Annexin V結(jié)合液重懸細(xì)胞，然后加入5μl Annexin V-FITC 混勻后，避光15 min，再加入10μl 碘化丙啶混勻，避光反應(yīng)5 min，上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.4 Western blotting收集加藥處理后的細(xì)胞，PBS清洗3 遍，加入細(xì)胞裂解液重懸，超聲破碎10 s，冰上靜置3 min，重復(fù)3 次。以4℃、12 000 r/min 離心30 min，提取上清液，測定蛋白濃度。10% SDS-PAGE電泳2 h，恒流300 mA 轉(zhuǎn)膜90 min，5%脫脂牛奶封閉2 h，按照1 ∶500 稀釋并加入一抗（Bax、Bcl-2、PARP、Cleaved Caspase-9 或Cleaved Caspase-3），4℃過夜，室溫孵育二抗1 h，洗膜、加超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑曝光顯影。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度那可丁處理后的Tca8113 細(xì)胞存活率比較及最佳藥物濃度篩選

0、5、10、20、40、60 及80μmol/L 的那可丁處理后的Tca8113 細(xì)胞存活率分別為（100.00±0.00）%、（89.98±0.61）%、（83.83±1.90）%、（72.44±1.19）%、（58.32±1.15）%、（44.47±1.26）%和（40.11±1.68）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=997.488，P=0.000），隨著那可丁濃度逐漸增大，細(xì)胞存活率逐漸下降。本實驗顯示，40μmol/L 的那可丁處理Tca8113細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞存活率約58%，選定40μmol/L 做為最佳藥物濃度，后續(xù)試驗均采用此條件。見圖1。

2.2 各組Tca8113 細(xì)胞存活率比較

圖1 不同濃度那可丁處理后Tca8113 細(xì)胞存活率變化趨勢

空白對照組、奧沙利鉑組、那可丁組和聯(lián)合用藥組的Tca8113 細(xì)胞存活率分別為（100.00±0.00）%、（70.17±1.43）%、（59.90±1.19）%和（50.79±1.28）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=716.017，P=0.000）。奧沙利鉑組、那可丁組和聯(lián)合用藥組較空白對照組低（P＜0.05），聯(lián)合用藥組較奧沙利鉑組、那可丁組低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組Tca8113 細(xì)胞存活率比較 （±s）

2.3 各組Tca8113 細(xì)胞凋亡形態(tài)

在熒光顯微鏡下觀察到，空白對照組細(xì)胞核規(guī)整呈圓形或卵圓形，呈均勻淡藍(lán)色熒光。奧沙利鉑組、那可丁組和聯(lián)合用藥組的細(xì)胞均可見不規(guī)則碎裂、核固縮明顯，且比例逐漸增多，高強(qiáng)度亮藍(lán)熒光較空白對照組強(qiáng)，細(xì)胞凋亡顯著增多。聯(lián)合用藥組較奧沙利鉑組和那可丁組凋亡更明顯。見圖3。

2.4 各組Tca8113 細(xì)胞凋亡率比較

空白對照組、奧沙利鉑組、那可丁組和聯(lián)合用藥組的Tca8113 細(xì)胞凋亡率分別為（5.27±1.42）%、（17.20±1.20）%、（23.07±3.04）%和（29.30±3.92）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=29.827，P=0.000），奧沙利鉑組、那可丁組和聯(lián)合用藥組較空白對照組高（P＜0.05），聯(lián)合用藥組較奧沙利鉑組、那可丁組高（P＜0.05）。這說明聯(lián)合用藥組誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡更顯著。見圖4、5。

圖3 各組Tca8113 細(xì)胞凋亡形態(tài) （×200）

2.5 各組Tca8113 細(xì)胞Bax、Bcl-2、PARP、Cleaved Caspase-9 和Cleaved Caspase-3 蛋白的相對表達(dá)量比較

各組Tca8113 細(xì)胞Bax、Bcl-2、PARP、Cleaved Caspase-9 和Cleaved Caspase-3 蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），奧沙利鉑組、那可丁組和聯(lián)合用藥組Bax、PARP、Cleaved Caspase-9 及Cleaved Caspase-3 的蛋白表達(dá)較空白對照組高（P＜0.05），而Bcl-2 的蛋白表達(dá)較空白對照組低（P＜0.05），聯(lián)合用藥組Bax、PARP、Cleaved Caspase-9 及Cleaved Caspase-3 的蛋白表達(dá)較奧沙利鉑組、那可丁組高（P＜0.05），Bcl-2 的蛋白表達(dá)較奧沙利鉑組、那可丁組低（P＜0.05）。見表1和圖6。

圖4 各組流式細(xì)胞圖

圖5 各組Tca8113 細(xì)胞凋亡率比較 （±s）

表1 各組Tca8113細(xì)胞Bax、Bcl-2、PARP、Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3蛋白的相對表達(dá)量比較 （±s）

表1 各組Tca8113細(xì)胞Bax、Bcl-2、PARP、Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3蛋白的相對表達(dá)量比較 （±s）

組別 PARP Cleaved Caspase-9 Bcl-2 Bax Cleaved Caspase-3空白對照組 0.702±0.049 0.672±0.042 1.353±0.061 0.799±0.012 0.687±0.059奧沙利鉑組 1.118±0.135 1.086±0.116 1.076±0.047 1.247±0.045 1.043±0.100那可丁組 1.214±0.086 1.274±0.130 0.879±0.019 1.579±0.049 1.266±0.211聯(lián)合用藥組 1.521±0.084 1.642±0.114 0.750±0.043 1.870±0.022 1.706±0.155 F 值 26.017 28.792 67.144 336.520 17.716 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.001

圖6 各組Tca-8113 細(xì)胞Bax、Bcl-2、PARP、Cleaved Caspase-9 和Cleaved Caspase-3 蛋白的相對表達(dá)量比較

3 討論

那可丁作為鎮(zhèn)咳藥被廣泛研究。近年來發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)與秋水仙堿相似，發(fā)現(xiàn)其在抗腫瘤活性篩選過程中通過抑制微管蛋白具有一定的抗腫瘤活性[11]。有研究表明，那可丁通過與微管蛋白結(jié)合促進(jìn)微管聚合，在有絲分裂過程中誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長停滯，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[12]。TIAN 等[12]指出，與常用的化療藥物相比，那可丁沒有表現(xiàn)出嚴(yán)重的毒副作用，是一種安全的抗腫瘤藥物。有研究表明那可丁對多種癌細(xì)胞均有很強(qiáng)的抑制作用[13-14]。XU 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，那可丁抑制肝癌HepG2 和Huh7 細(xì)胞的活性具有劑量和時間依賴性，在小鼠異種移植模型中，能在不影響小鼠體重的前提下，顯現(xiàn)出對肝癌的抑制作用。但關(guān)于那可丁聯(lián)合奧沙利鉑誘導(dǎo)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113 細(xì)胞凋亡的研究目前鮮有報道。本研究CCK-8 實驗結(jié)果顯示，與空白對照組、奧沙利鉑組和那可丁組相比，聯(lián)合用藥組細(xì)胞存活率更低；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率明顯升高并且高于那可丁組與奧沙利鉑組，表明那可丁聯(lián)合奧沙利鉑有協(xié)同抗腫瘤作用。

細(xì)胞凋亡是一種程序性的細(xì)胞死亡，是通過內(nèi)源性（線粒體介導(dǎo)）與外源性兩種獨(dú)立的通路調(diào)控[16]。有研究表明，線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性通路與Bax、Bcl-2、Caspase-9 和Caspase-3 等蛋白密切相關(guān)[17-18]。本研究通過檢測內(nèi)源性通路的相關(guān)蛋白表達(dá)，進(jìn)一步探究那可丁聯(lián)合奧沙利鉑可協(xié)同抑制人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113 細(xì)胞的生長。Bcl-2 家族成員對調(diào)節(jié)線粒體信號通路中細(xì)胞色素C 的釋放起著關(guān)鍵作用[19]?？沟蛲龅鞍譈cl-2 通過抑制細(xì)胞色素C 從線粒體釋放到胞漿中來阻斷細(xì)胞凋亡，而促凋亡蛋白Bax 通過破壞線粒體膜的完整性來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。有研究表明，一旦細(xì)胞色素C 釋放到線粒體外膜，關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行因子Caspase-3 被凋亡激活因子Caspase-9 激活，隨后觸發(fā)PARP 的裂解，PARP 主要參與DNA 修復(fù)，對不同的凋亡信號刺激作出不同反應(yīng)，并成為凋亡細(xì)胞的標(biāo)志物[21]。郝亞偉等[10]研究發(fā)現(xiàn)那可丁聯(lián)合順鉑作用于人骨肉瘤MG-63 細(xì)胞系后，導(dǎo)致Bcl-2/Bax 的表達(dá)失衡，通過內(nèi)源性通路，激活Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，促使細(xì)胞凋亡。本研究實驗結(jié)果顯示，奧沙利鉑組、那可丁組和聯(lián)合用藥組Bcl-2 蛋白表達(dá)較空白對照組下調(diào)，同時PARP、Caspase-9、Caspase-3 及Bax 蛋白表達(dá)較空白對照組上調(diào)，且聯(lián)合用藥組效果優(yōu)于單獨(dú)奧沙利鉑組與那可丁組，這提示那可丁聯(lián)合奧沙利鉑對誘導(dǎo)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113 細(xì)胞的凋亡具有協(xié)同作用。筆者推測那可丁聯(lián)合奧沙利鉑可能通過線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性通路誘導(dǎo)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113 細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究表明那可丁聯(lián)合奧沙利鉑可能通過內(nèi)源性的線粒體途徑誘導(dǎo)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113 細(xì)胞凋亡，且那可丁聯(lián)合奧沙利鉑對Tca8113細(xì)胞的生長具有協(xié)同抑制作用。當(dāng)兩者聯(lián)合應(yīng)用時，降低了化療藥物所占的給藥比例，減少了毒副作用，并增強(qiáng)了對腫瘤細(xì)胞的抑制作用。