飼料中喹乙醇?xì)埩舻拿庖呖焖贆z測

王敏思，朱文博，柳 雙，張志軍，宋 洋

（1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；2.天津師范大學(xué) 天津市動植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387；3.國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心（天津），天津市農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300384）

喹乙醇（olaquindox，OLA）又稱喹酰胺醇、倍育諾、快育靈，分子式為C12H13N3O4，CAS號為23696-28-8.它是一種生長促進(jìn)劑，可促進(jìn)蛋白質(zhì)合成代謝，提高飼料的能量利用率和禽畜個(gè)體瘦肉率[1]，被廣泛用作豬、魚的飼料添加劑以提高飼料轉(zhuǎn)化效率[2].近年來，喹乙醇被稱為“水產(chǎn)養(yǎng)殖瘦肉精”[3].大量喹乙醇對動物有毒害作用，在動物體內(nèi)富集會通過食物鏈導(dǎo)致人致畸、致癌和致突變.喹乙醇的毒性因動物種類不同而不同，對家禽和魚類具有顯著的毒性[4]和特定的遺傳毒性[5].因此，歐盟自1999年以來完全禁止使用喹乙醇[6].中華人民共和國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)的國家獸藥標(biāo)準(zhǔn)《中華人民共和國獸醫(yī)藥典》和2001年頒布的《飼料添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》明確規(guī)定，喹乙醇在養(yǎng)殖業(yè)中的使用只能用于體質(zhì)量不足35 kg的豬，飼料添加量為50 mg/kg，禁止用于家禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖的飼料中[7].2018年1月11日，農(nóng)業(yè)部第2638號公告公布，自2018年5月1日起，在養(yǎng)殖業(yè)中禁止使用喹乙醇.基于此，建立簡便、靈敏、符合國家最新規(guī)定的檢測喹乙醇?xì)埩舻姆治龇椒ㄊ直匾?

目前，檢測喹乙醇常用的方法有高效液相色譜法（HPLC）[8]（HPLC與質(zhì)譜聯(lián)用[9]）、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）[10]、仿生酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（BELISA）[11]和定量金免疫層析法[12].2008年Zhao等[10]設(shè)計(jì)了2種結(jié)構(gòu)抗原，建立了間接競爭性酶聯(lián)免疫方法（ic-ELISA）檢測動物飼料中的喹乙醇，2種抗體的靈敏度（IC50）分別為16.0μg/L和19.0μg/L，檢測限（IC15）分別為0.24μg/L和1.02μg/L.2013年Zhao等[11]建立了直接競爭性仿生酶聯(lián)免疫吸附測定方法，測定雞飼料中的喹乙醇，IC50和IC15分別為（700.0±60.0）μg/L和（17.0±1.6）μg/L，靈敏度和檢測限相對其他方法較低.2016年P(guān)ei等[13]建立了金標(biāo)免疫層析法（GICA）分析動物飼料樣品中的喹乙醇，IC50為3.35μg/L，回收率范圍為77.33%～86.91%，（變異系數(shù)范圍為11.47%～23.62%），盡管GICA方法有較高的靈敏度，但準(zhǔn)確性有待提高.

本研究基于實(shí)驗(yàn)室制備的高靈敏度和特異性的喹乙醇多克隆抗體，擬建立雞、魚、豬的3種典型飼料中喹乙醇?xì)埩舻目焖贆z測方法.通過優(yōu)化及簡化3種樣品的前處理方法，有效縮短前處理步驟和檢測時(shí)間，實(shí)現(xiàn)對雞、魚、豬飼料實(shí)際樣品的高效和快速檢測.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

喹乙醇，加拿大TRC公司；酶標(biāo)二抗（羊抗鼠），中國上海斯信生物技術(shù)有限公司；牛血清蛋白（BSA），生工生物工程（上海）股份有限公司；β-環(huán)糊精，德國Merck公司；過氧化氫脲、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），美國Sigma公司；二甲基亞砜（DMSO），中國J＆K公司；NaH2PO4·2H2O，天津金海華興科技發(fā)展有限公司；Na2HPO4·12H2O，天津市大茂化學(xué)試劑廠；檸檬酸，成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司.

pH值為9.6的碳酸鈉緩沖液（包被緩沖液）；PBS（0.01 mol/L磷酸鈉緩沖液，pH值為7.4）；PBST（1 L PBS加0.50 g吐溫）；PBST（1L PBS加0.10 g K2CO3）；PBSB（100 mL PBS+0.1 g BSA）；4.30 mg/mL喹乙醇多克隆抗體（本實(shí)驗(yàn)室合成）；樣品提取液（甲酸和15%甲醇水溶液的體積比為1∶99）.

1.2 儀器與設(shè)備

全波長酶標(biāo)儀（Labsystems），英國雷勃公司；96孔酶標(biāo)滴定板，丹麥Nunc公司；數(shù)顯型酶標(biāo)板振蕩器，美國IKA公司.

1.3 喹乙醇間接競爭ELISA方法的建立

用包被液稀釋包被原，使每個(gè)孔的量分別為0.125、0.250、0.500、1.000、2.000μg；將酶標(biāo)二抗分別稀釋2 500、5 000、10 000、20 000倍；將競爭反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)置為30、40、50、60 min.反應(yīng)在96孔酶標(biāo)滴定板中進(jìn)行，用酶標(biāo)儀讀取A450nm和A650nm值，根據(jù)結(jié)果中IC50值的大小和吸光度的變化選擇最佳反應(yīng)條件.

利用上述得到的優(yōu)化條件，分別將喹乙醇配制成0.030、0.300、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000μg/kg的溶液，進(jìn)行ic-ELISA實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)結(jié)果以喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（μg/kg）為橫坐標(biāo)，以抑制率（inhibition rate，%）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

式（1）中：A質(zhì)控為喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度為零時(shí)的吸光度；Ax為喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度為x時(shí)的吸光度；A空白為空白孔的吸光度.

1.4 抗體特異性的評估

通過抗原以及其他抗原結(jié)構(gòu)類似物與抗體的交叉反應(yīng)率（CR）來判斷抗體的特異性[14].

式（2）中：IC50(喹乙醇)為喹乙醇的抑制率為50%時(shí)對應(yīng)的喹乙醇濃度；IC50(其他標(biāo)準(zhǔn)品)為其他標(biāo)準(zhǔn)品的抑制率為50%時(shí)對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度.

1.5 樣品的測定

1.5.1 樣品的準(zhǔn)備與處理

分別選擇3種飼料（雞飼料、豬飼料、魚飼料）作為樣品去評估ic-ELISA方法的各項(xiàng)性能指標(biāo).所有樣品來自當(dāng)?shù)厥袌觯ㄌ旖颍瑯悠方?jīng)HPLC檢測確保其不含喹乙醇.樣品經(jīng)打磨至均質(zhì)，備用.

1.5.2 基質(zhì)影響的消除

魚飼料：精確稱量1.00 g飼料樣品（精確到0.01 g）和0.01 g PSA置于離心管中，加入2 mL樣品提取液，渦旋5 min，10 000 r/min、5℃下離心10 min，取上清液1 mL過0.45μm濾膜，PBS稀釋2倍待測.

豬、雞飼料：精確稱量1.00 g飼料樣品置于離心管中，加入1 mL樣品提取液，10 000 r/min、5℃下離心10 min，取1 mL上清液，用PBST（1 L PBS加0.10 g K2CO3）稀釋3倍待測.

1.5.3 添加回收實(shí)驗(yàn)

利用添加回收實(shí)驗(yàn)評估ic-ELISA方法的準(zhǔn)確度.具體步驟如下：分別對3種飼料樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每種樣品分別添加3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（30、100、200μg/kg），每個(gè)重復(fù)3次.樣品提取液經(jīng)間接競爭ELISA法分別檢測后，計(jì)算其回收率（recovery rate），根據(jù)回收率接近100%的程度來檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度.

1.5.4 實(shí)際樣品的檢測

對天津市場的不同品牌飼料進(jìn)行抽樣調(diào)查，每種樣品有6種不同來源，每個(gè)樣品有3個(gè)平行.

1.6 方法比對實(shí)驗(yàn)

檢測條件及方法參考文獻(xiàn)[15]，樣品處理方法參考文獻(xiàn)[16].稱取5.00 g飼料，加入10 mL提取液（體積分?jǐn)?shù)為5%的甲醇溶液），室溫振蕩45 min，3 000 r/min離心10 min，分離出上清液.取SPE小柱，分別加2 mL甲醇和2 mL水，對小柱進(jìn)行活化.取2 mL上清液過小柱，分別用0.02 mol/L鹽酸2 mL、5%的甲醇溶液淋洗，最后用2 mL甲醇溶液（體積分?jǐn)?shù)為40%）洗脫.洗脫液過0.22μm有機(jī)相濾膜，濾液上機(jī)測定.

2 結(jié)果與分析

2.1 ic-ELISA方法的建立

本研究對包被原包被量、酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)以及競爭反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，最終確定的最優(yōu)條件為：抗體稀釋165 000倍，包被原包被量為0.5μg/well，酶標(biāo)二抗稀釋10 000倍，抗原抗體競爭反應(yīng)時(shí)間為50min.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，其中，IC15=（0.6±0.2）μg/L，IC50=（3.2±0.3）μg/L.由圖1可以看出，在0.9～8.0μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好.

圖1 喹乙醇抑制曲線Fig.1 Olaquindox inhibition curve

2.2 抗體特異性

利用測定抗體與喹乙醇及其他結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率來評價(jià)抗體的特異性.本研究選擇幾種喹乙醇結(jié)構(gòu)類似物和功能類似物進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示.

表1 各化合物與抗體的交叉反應(yīng)率和IC50值Tab.1 IC50 and CR of some compounds with antibody

由表1可以看出，喹乙醇抗體除了能夠有效識別喹乙醇外，與其他喹乙醇類似物的交叉反應(yīng)率均較低.由于喹烯酮和乙酰甲喹與喹乙醇有相似的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，與抗體有一定的親和性，因此喹烯酮交叉反應(yīng)率為3.00%，乙酰甲喹為2.20%.其他結(jié)構(gòu)類似物（卡巴多、鹽酸克倫特羅、氯霉素）的交叉反應(yīng)率均小于0.01%.說明該抗體的特異性非常好，能夠有效檢測樣品中的喹乙醇?xì)埩?

2.3 基質(zhì)影響消除結(jié)果

豬、魚、雞的3種飼料樣品經(jīng)間接競爭ELISA檢測獲得的抑制率曲線和吸光值曲線分別如圖2（a）和2（b）所示.

圖2 喹乙醇間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 ic-ELISA calibration curve of olaquindox

抑制率曲線即為樣品的基質(zhì)曲線.由圖2可以看出，3種飼料的抑制率曲線和吸光值曲線均與標(biāo)準(zhǔn)曲線基本重合，由此可知，樣品的前處理方法基本可以達(dá)到消除基質(zhì)影響的目的.

2.4 添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將每種飼料樣品勻漿添加喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)品，使其最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.0、4.0、8.0μg/kg，每個(gè)水平設(shè)置3個(gè)平行，分別用ic-ELISA和HPLC進(jìn)行檢測，結(jié)果如表2所示.由表2可以看出，ic-ELISA回收率為80.0%～100.0%，變異系數(shù)（CV）為2.3%～11.1%；HPLC回收率為70.0%～107.5%，變異系數(shù)為1.6%～9.9%.2種方法的檢測結(jié)果基本一致，因此認(rèn)為ic-ELISA方法可以用于飼料樣品中喹乙醇的檢測.豬、雞、魚的3種飼料的檢出限分別為6.0、6.0、4.0μg/kg.

表2 喹乙醇在3種樣品中的添加回收率Tab.2 Recovery of olaquindox in three kinds of samples

2.5 實(shí)際樣品測定

分別用ic-ELISA和HPLC方法檢測市售的18件飼料，結(jié)果如表3所示.

表3 實(shí)際樣品中的喹乙醇的檢測Tab.3 Detection of olaquindox in real samples

由表3可以看出，3種飼料中均檢測出了喹乙醇，總檢出率為50%，但并未超標(biāo).豬飼料中檢出的喹乙醇含量都相對較高，雞飼料次之，魚飼料相對比較低.同時(shí)發(fā)現(xiàn)檢出率較高的是雞飼料，為66.7%；其次是豬飼料，為50%；魚飼料最低，為33.3%.3種飼料中喹乙醇的添加均未超標(biāo).

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于ic-Elisa方法，建立了一種快捷、靈敏、準(zhǔn)確的飼料中喹乙醇的檢測方法.該方法的IC50為（3.2±0.3）μg/L，IC15為（0.6±0.2）μg/L，線性范圍為0.9～8.0μg/L.雞、魚、豬飼料樣品經(jīng)提取、離心、稀釋過膜后，其基質(zhì)影響可基本消除，整個(gè)檢測時(shí)間僅需2.5 h.通過添加回收實(shí)驗(yàn)和HPLC實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該方法有效.3種樣品的實(shí)際檢出限分別為6.0、4.0、6.0μg/kg，均低于已報(bào)道的其他方法.因此認(rèn)為，本研究建立的ic-Elisa方法可高效、準(zhǔn)確地檢測飼料中的喹乙醇.與以往方法相比，該方法的樣品檢出限更低，可實(shí)現(xiàn)雞、魚、豬3種飼料中喹乙醇的精準(zhǔn)定性定量分析.