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    不同提取方式對山楂葉多糖提取率和抗氧化活性的影響

    2020-09-24 04:58:44李釗李寧寧王宇波陳松猛趙圣明馬漢軍
    關(guān)鍵詞:山楂熱水清除率

    李釗,李寧寧,王宇波,陳松猛,趙圣明,馬漢軍

    (河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003)

    山楂為薔薇科山楂屬植物,果實酸甜可口,有健胃消食、生津止渴的功效,在我國遼寧、河北、山東、江西、云南等地均有廣泛栽培[1].山楂葉在我國的藥用歷史已有上千年,民間用其泡茶,有強心、降血脂、降血壓、減肥、活血化瘀等功效[2].山楂葉的藥用價值最早可見于東晉中醫(yī)方劑著作《肘后方》中“莖葉煮汁,洗漆瘡”的記載,《唐本草》《本草綱目》《中國藥典》等書也記載有山楂葉的藥理作用.現(xiàn)代藥理研究表明,山楂葉富含黃酮類、多糖類、三萜類等多種活性成分,有理氣通脈、化濁降脂、抗菌消炎等功效[3].

    植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、鎮(zhèn)痛、降糖降脂、抑菌、抗腫瘤等作用[4-7],在治療糖尿病、抗腫瘤等臨床治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景.隨著山楂葉提取物在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療[8],山楂葉的功能活性研究越來越深入.大量的動物體外實驗驗證了山楂葉黃酮具有抗血栓、降血脂、抗氧化、抗心肌缺血、抗動脈粥樣硬化、強心等功能[9-10].山楂葉中多糖含量較高,而關(guān)于山楂葉多糖的研究報道相對較少,目前山楂葉多糖的功能活性研究僅局限于降血壓、降血脂功效的研究報道[11],且國內(nèi)關(guān)于提取工藝的相關(guān)研究也鮮有報道,前人的研究僅報道了常規(guī)熱水提取法[12]和利用已提取過黃酮的山楂葉為原料,采用超聲波法提取山楂葉多糖[13].傳統(tǒng)熱水提取法提取山楂葉多糖方法簡單,使用儀器少,但多糖提取率較低.超聲波具有能量大、能耗低、破碎能力強、不影響有效成分等特點;微波具有選擇性強、適用范圍廣、省時高效、受熱體系溫度均勻、不產(chǎn)生噪聲和污染等特點,這兩項技術(shù)已經(jīng)在快速穩(wěn)定提取高純度植物多糖等方面進行了廣泛的應(yīng)用[14].關(guān)于超聲波和微波技術(shù)對提取山楂葉多糖是否具有良好的效果還不明晰.河南新鄉(xiāng)南太行地區(qū)野生山楂資源豐富,研究山楂葉多糖的提取工藝,不僅可為山楂葉多糖功能活性的研究提供一定的基礎(chǔ),還可以變廢為寶,開發(fā)山楂葉作為功能活性物質(zhì)的新來源,滿足日益增長的天然保健食品和天然保健藥物的需求.本文以山楂葉干粉為原料,研究超聲波提取、微波提取和熱水提取3 種不同提取方式最佳提取工藝和對山楂葉多糖抗氧化活性的影響, 為山楂葉多糖的深化研究提供一定的參考依據(jù).

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    山楂葉,采自新鄉(xiāng)太行山野生山楂樹,2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH),無水乙醇,硫酸亞鐵(FeSO4),水楊酸,過氧化氫(H2O2),磷酸氫二鈉,磷酸二氫鈉,鐵氰化鉀,三氯乙酸,三氯化鐵等化學(xué)藥品均為國產(chǎn)分析純.

    1.2 主要儀器

    HH-42 水浴鍋,常州國華電器有限公司;PJ-04A 多功能粉碎機,海助邦貿(mào)易有限公司;PS-30AD 數(shù)控超聲波清洗器,市潔康洗凈電器有限公司;美的EV025LC7-NR 變頻微波爐,佛山市順德區(qū)美的微波爐電器制造有限公司;離心機,美國Beckman L-80-XP Ultracentrifuge;ShimadzuAUY120 電子天平,日本島津公司;GZX-9240MBE 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;722N 型可見分光光度計,上海菁華科技儀器有限公司.

    1.3 試驗方法

    1.3.1 山楂葉干粉的制備 選擇色澤一致、大小均一、且無病蟲害的山楂葉用蒸餾水洗凈,陰干后放入50 ℃恒溫干燥箱中干燥2 h,粉碎,得山楂葉粗粉備用.

    1.3.2 熱水浸提法 準確稱取1 g 山楂葉干粉,按料液比為1:10、1:20、1:30(m:V)加入純水混勻均勻后,分別在60 ℃、80 ℃、90 ℃溫度條件下熱水浸提3 h.浸提結(jié)束后將提取液在5 000 r/min 的轉(zhuǎn)速下離心10 min,收集上清液.向上清液中加入3 倍體積無水乙醇進行醇沉,4 ℃放置過夜后,5 000 r/min 離心10 min 得沉淀物.加入少量體積的蒸餾水收集沉淀,在50 ℃恒溫干燥箱中干燥得山楂葉粗多糖[15].每個樣品重復(fù)3次,取平均值,確定最佳提取溫度與料液比.

    1.3.3 微波輔助水提法 準確稱取1 g 山楂葉干粉,按料液比1:10、1:20、1:30(m:V),加入純水混勻均勻后,放入微波爐中.微波功率分別設(shè)置為100 W、300 W、500 W,微波處理5 min 后,90 ℃熱水浸提3 h[16].最后按照1.3.2 的方法離心、沉淀、干燥得山楂葉粗多糖,確定最佳提取料液比與功率.

    1.3.4 超聲波輔助水提法 準確稱取1 g 山楂葉干粉,按料液比為1:10、1:20、1:30(m:V),加入純水混勻均勻后,放入超聲波儀器中,設(shè)置溫度上限為50 ℃.超聲波功率分別設(shè)置為50 W、80 W、100 W,超聲波處理60 min 后,90 ℃熱水浸提3 h.最后按照1.3.2 的方法離心、沉淀、干燥得山楂葉粗多糖[17],確定最佳提取料液比與功率.

    1.3.5 山楂葉粗多糖的提取 準確稱取山楂葉干粉20 g, 取不同提取方式的最優(yōu)提取工藝進行山楂葉多糖的提取,浸提結(jié)束后將樣液離心(5 000 r/min,10 min),將上清液收集.然后采用旋蒸儀將上清液體積濃縮至原來體積的1/4,再將3 倍體積無水乙醇加入到濃縮的上清液中進行醇沉,在4 ℃條件下放置12 h后,離心(5 000 r/min,10 min)得沉淀物[18].加入少量體積的蒸餾水溶解沉淀,沉淀溶解后,濃縮至一定的體積,分裝至培養(yǎng)皿中,-20 ℃預(yù)凍后,真空冷凍干燥后得到山楂葉粗多糖.

    1.3.6 不同提取方法山楂葉多糖對Fe3+還原力的測定[19]向2 mL 不同質(zhì)量分數(shù)的樣品溶液(0.03%,0.06%,0.09%,0.12%,0.15%)中加入2 mL 濃度為0.2 mol/L 的磷酸鹽緩沖液(pH=6.6)和2 mL 質(zhì)量分數(shù)為1%的鐵氰化鉀溶液,50 ℃水浴加熱20 min 后再加入2 mL 質(zhì)量分數(shù)為10%的三氯乙酸溶液, 混合均勻后經(jīng)3 000 r/min 離心處理10 min,取上清液2 mL,加入2 mL 蒸餾水以及0.4 mL 質(zhì)量分數(shù)為0.1%的三氯化鐵溶液,室溫反應(yīng)10 min 后,測定其在700 nm 處的吸光值.每個樣品做3 次重復(fù)試驗取平均值.

    1.3.7 不同提取方法山楂葉多糖DPPH 自由基清除能力的測定 向2 mL 不同質(zhì)量分數(shù)的樣品溶液(0.03%,0.06%,0.09%,0.12%,0.15%)加入 2 mL 濃度為 0.16 mmol/L 的 DPPH(DPPH 溶解在 95%的乙醇中)溶液,25℃水浴加熱30 min 后,在517 nm 測得樣液吸光度(Ai).以2 mL 蒸餾水代替上述體系中2 mL 樣品測得空白吸光度(A0).同時以 2 mL 蒸餾水代替上述體系中 2 mL 的 DPPH 測得吸光度(Aj).Ai和Aj 每個質(zhì)量濃度需要做3 個重復(fù)試驗,A0 只需做3 個平行.最后計算清除率取平均值[20-21].

    1.3.8 不同提取方法山楂葉多糖·OH 自由基清除能力的測定 在10 mL 比色管中按順序加入2.0 mL 濃度為6 mmol/L 的FeSO4溶液,2.0 mL 濃度為 6 mmol/L 的水楊酸溶液,2.0 mL 濃度為 6 mmol/L 的H2O2溶液和2 mL 不同質(zhì)量分數(shù)的樣品溶液(0.03%,0.06%,0.09%,0.12%,0.15%)混合均勻,37 ℃水浴處理30 min后測定其在510 nm 處的吸光度(Ai),然后將體系中的樣品改為加入2 mL 蒸餾水,測定其在510 nm處的吸光度為空白對照吸光度(A0),同時以2 mL 蒸餾水代替上述體系中2 mL 的H2O2測得本底吸光度(Aj).Ai 和Aj 每個質(zhì)量樣品濃度做3 個平行,A0 做3 個平行.最后計算清除率取平均值[22-23].

    1.4 統(tǒng)計分析

    試驗數(shù)據(jù)平行測定3 次,測定平均值,采用Origin2018 軟件作圖,應(yīng)用SPSS26 軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析,差異顯著性水平為P<0.05.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同參數(shù)條件和提取方式對山楂葉多糖提取率的影響

    2.1.1 熱水浸提法對山楂葉多糖提取率的影響 不同條件熱水浸提法對山楂葉多糖提取率的影響結(jié)果見表1.

    表1 不同條件熱水浸提法對山楂葉多糖提取率的影響Tab.1 Effect of hot water immersion in different conditions on the rate of polysaccharide extraction of Hawthorn Leaves

    由表1 可知,當(dāng)提取溫度由50 ℃升高到80 ℃時,多糖提取率逐漸提高;當(dāng)溫度由80 ℃升高到90 ℃時,多糖提取率顯著提高.根據(jù)趙寧等[24]的報道熱水浸提白芨多糖溫度高于90 ℃后,多糖提取率反而下降,可能是溫度過高使多糖發(fā)生了降解,綜合考慮確定水浴最佳溫度為90 ℃.在相同的溫度條件下,山楂葉多糖的提取率隨料液比的增大而不斷提高.許瑞波[12]報道稱提取山楂葉多糖時,料液比從1:30 提高到1:40 對山楂葉多糖提取率提升效果不明顯,而提取液的增加會延長后續(xù)的濃縮提取時間,故熱水浴最優(yōu)料液比確定為1:30.

    2.1.2 微波輔助水提法對山楂葉多糖提取率的影響 不同條件微波輔助水提法對山楂葉多糖提取率的影響結(jié)果見表2.

    表2 不同條件微波輔助水提法對山楂葉多糖提取率的影響Tab.2 Effect of microwave-assisted water formulation on the rate of polysaccharide extraction of Hawthorn Leaves

    由表2 可知,當(dāng)微波功率由100 W 增大到300 W 時,多糖提取率顯著提高;由300 W 增大到500 W時,提取率增加的幅度明顯變低.龔盛昭等[16]報道微波提取黃芪多糖功率高于450 W 時,多糖提取率由于提取液沸騰從提取器中溢出而降低,且過高的微波功率有破壞山楂葉多糖活性的可能,綜合考慮確定微波功率以300 W 為佳.在相同的微波功率條件下,山楂葉多糖的提取率隨料液比的增大而不斷提高,故超聲波輔助水提法料液比也確定為1:30.

    2.1.3 超聲波輔助水提法對山楂葉多糖提取率的影響 不同條件超聲波輔助水提法對山楂葉多糖提取率的影響結(jié)果見表3.

    表3 不同條件超聲波輔助水提法對山楂葉多糖提取率的影響Tab.3 Effect of ultrasonic-assisted water formulation in different conditions on the rate of polysaccharide extraction of Hawthorn Leaves

    由表3 可知,當(dāng)超聲波功率由50 W 增大到80 W 時,多糖提取率明顯提高;由80 W 增大到100 W時,提取率增加的幅度明顯變低.呂明生等[25]報道超聲波提取雪蓮薯多糖功率大于80 W 時,多糖提取率反而降低,可能是多糖在持續(xù)的高功率超聲作用下緩慢降解,根據(jù)前人的研究報道結(jié)合本試驗的研究結(jié)果,確定超聲波提取功率100 W 為最佳.在相同的超聲波功率條件下,山楂葉多糖的提取率隨料液比的增大而不斷提高,這與熱水浸提法多糖提取率隨料液比的變化規(guī)律大致相似,故超聲波輔助水提法料液比也確定為1:30.

    2.2 不同提取方式對山楂葉多糖抗氧化活性的影響

    2.2.1 對提取量的影響 以20 g 山楂葉粗干粉為提取樣品,經(jīng)過3 種不同提取方法提取后,最終熱水提取法得到0.748 0 g,微波輔助水提法得到0.984 5 g,超聲波輔助水提法得到1.081 5 g.超聲波和微波輔助水提法得到山楂葉粗多糖的量明顯高于熱水提取的量.這可能是因為經(jīng)微波處理后,細胞內(nèi)溫度壓強升高,加速細胞壁的破壞,而超聲波的震蕩作用也能加速細胞壁的破壞,導(dǎo)致更多的多糖溶解出來.

    2.2.2 總還原能力 抗氧化活性與還原力之間存在直接的關(guān)系,若抗氧化物質(zhì)的還原力越強,則該抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性越強.因此,測定抗氧化物質(zhì)的還原力,可以間接便顯出抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性.通常向抗氧化物質(zhì)的溶液中添加鐵氰化鉀來表現(xiàn)還原力,體系中的Fe3+在抗氧化劑的作用下生成Fe2+,Fe2+在700 nm 處有吸收峰,可通過分光光度計測出.當(dāng)吸光度越大,則表明該體系中的Fe2+越多,還原力越強[26-27].不同方式提取山楂葉多糖的總還原能力結(jié)果見圖1.

    圖1 不同方式提取山楂葉多糖的總還原能力Fig.1 Total reduction capacity of Hawthorn Leaf polysaccharide in different extraction methods

    由圖1 可知,超聲波提取山楂葉多糖,微波提取多糖和水提取多糖的總還原能力與質(zhì)量分數(shù)呈正比關(guān)系,隨著質(zhì)量分數(shù)的增加,不同方式提取山楂葉多糖的總還原能力也隨之增加,同時任何一種提取多糖方式的總還原能力也顯著性增加(P<0.05).超聲波提取山楂葉多糖的總還原能力強于微波提取和熱水提取,當(dāng)質(zhì)量分數(shù)大于0.12%時,超聲波提取多糖的總還原能力上升幅度明顯高于微波提取和熱水提取.綜上所述,不同方式提取山楂葉多糖的總還原能力:超聲波提?。疚⒉ㄌ崛。緹崴崛?分析原因可能是:超聲波提取時間大大縮短,對多糖生物活性損傷小,同時也避免了多余的氧化化學(xué)反應(yīng);總還原能力的差異還可能與不同提取山楂葉多糖方式對多糖分子的單糖組成和糖苷鍵型的不同有很大關(guān)系[28].

    2.2.3 對DPPH 自由基的清除作用 測定抗氧化性的方法中,DPPH 法是較常用的一種檢測方法.DPPH自由基在有機溶劑中較穩(wěn)定,其DPPH 乙醇溶液呈深紫色,位于517 nm 處有吸收峰.抗氧化物質(zhì)可直接與DPPH 自由基發(fā)生反應(yīng),生成穩(wěn)定的抗磁分子,DPPH 乙醇溶液顏色也隨之變淺.根據(jù)吸光度變化可測定抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性.通過測定超聲波提取、微波提取及熱水提取山楂葉多糖對DPPH 自由基的清除率,以此分析對比不同提取方式對DPPH 自由基的清除能力[29].不同方式提取山楂葉多糖對DPPH自由基的清除效果結(jié)果見圖2.

    圖2 不同方式提取山楂葉多糖對DPPH 自由基的清除效果Fig.2 The removal effect of Hawthorn Leaf polysaccharide on DPPH free radicals in different ways

    由圖2 可知,隨著質(zhì)量分數(shù)的增加,不同方式提取山楂葉多糖對DPPH 自由基的清除率也呈正比增加,同時任何一種提取多糖方式對自由基清除率均顯著性增加.當(dāng)質(zhì)量分數(shù)在0.06%~0.09%時,超聲波提取多糖方式對DPPH 自由基清除率增長幅度明顯高于微波提取和熱水提取多糖對自由基的清除率.當(dāng)質(zhì)量分數(shù)為0.15%時,超聲波提取多糖對DPPH 自由基清除率為57.47%,而微波提取多糖和熱水提取多糖對其自由基的清除率僅為41.23%和35.20%.綜上所述,相同質(zhì)量分數(shù)時,超聲波提取山楂葉多糖對DPPH 自由基清除率優(yōu)于微波提取和熱水提取對其清除率, 且超聲波提取和微波提取山楂葉多糖對DPPH 的清除率均大于熱水提取對自由基的清除率.

    2.2.4 對·OH 的清除作用 羥自由基是目前已知的最強氧化劑, 可以通過H2O2與Fe2+反應(yīng)生成·OH,水楊酸可與·OH 發(fā)生反應(yīng),并產(chǎn)生能在510 nm 處有強烈吸收峰的有色物質(zhì).由于多糖分子具有還原性的半縮醛羥基,可以與·OH 發(fā)生反應(yīng),使水楊酸競爭的·OH 減少,從而產(chǎn)生的有色物質(zhì)減少[30].不同方式提取山楂葉多糖對·OH 的清除效果結(jié)果見圖3.

    圖3 不同方式提取山楂葉多糖對·OH 的清除效果Fig.2 Different ways to extract Hawthorn Leaf polysaccharide to the·OH purge effect

    由圖3 可知,山楂葉多糖對·OH 清除能力與質(zhì)量分數(shù)呈正相關(guān).表明不同方式提取山楂葉多糖對·OH清除效果與質(zhì)量分數(shù)有較大的依賴關(guān)系,隨著粗山楂葉多糖質(zhì)量分數(shù)的增加,對·OH 清除效果也隨著增加.3 種提取方式所得的山楂葉多糖對·OH 的清除能力增長趨勢大致一致,超聲波提取山楂葉多糖在質(zhì)量分數(shù)為0.15%時對·OH 清除率高達51.43%,表明高質(zhì)量分數(shù)的山楂葉多糖對·OH 也能達到較高的清除效果,能夠有效的抗氧化.相同質(zhì)量分數(shù)時,對·OH 清除率最高的為超聲波提取,其次為微波提取和熱水提取.綜上所述,不同方式提取山楂葉多糖對·OH 清除效果:超聲波提?。疚⒉ㄌ崛。緹崴崛?

    3 結(jié)論

    本研究對山楂葉多糖三種不同提取方法的參數(shù)進行優(yōu)化,根據(jù)試驗結(jié)果確定最適工藝條件.提取溫度90 ℃、料液比1:30、熱水浸提3 h 多糖提取率可達到5.45%;超聲波功率100 W 處理60 min、料液比1:30 熱水浸提3 h,多糖提取率可達到6.82%;微波功率300 W 處理5 min、料液比1:30、熱水浸提3 h,多糖提取率高達7.68%.結(jié)果表明,超聲波和微波均具有良好的提取山楂葉多糖的效果,其中微波的效果更好.

    不同提取方式對山楂葉多糖抗氧化活性試驗表明,超聲波提取山楂葉多糖、微波提取山楂葉多糖和熱水提取山楂葉多糖對DPPH 和·OH 均具有較好清除效果和還原能力,隨著質(zhì)量分數(shù)的增加,其清除效果和還原能力也隨著增加,研究結(jié)果表明山楂葉多糖具有較高的開發(fā)利用價值.超聲波提取山楂葉多糖對自由基的清除率和還原能力均大于微波提取和熱水提取,且時間短、效率高、節(jié)約成本,同時還可以防止提取時多糖發(fā)生其它的化學(xué)變化,可以作為提取山楂葉多糖抗氧化活性的主要手段.

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