PAK6、p53在膀胱癌中的表達(dá)及其臨床意義

董 宇 馬淑盟 劉 芬 路喜安

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，據(jù)研究顯示，膀胱癌發(fā)病率與病死率呈逐漸上升的趨勢(shì)，其復(fù)發(fā)率及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高，預(yù)計(jì)后期發(fā)展不容樂(lè)觀[1-4]。膀胱癌在65歲以上的人群中有很高的發(fā)病率，但近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，發(fā)病年齡逐漸降低，有低齡化趨勢(shì)，而男性發(fā)病率比女性高，男女發(fā)病率比例為3∶1～4∶1[5]。所以，目前要解決的問(wèn)題是尋找特異性靶向治療目標(biāo)。P21活化激酶(p21-activated kinases，PAKS)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，近年來(lái)有研究顯示，作為小G蛋白R(shí)ho家族Cdc42和Racl的下游效應(yīng)分子，在腫瘤細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞信息傳導(dǎo)、抑制細(xì)胞死亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞增生、血管生成等重要作用[6]。P21活化激酶6(p21-activated kinase 6，PAK6)是P21活化激酶的6個(gè)成員之一，也是首個(gè)發(fā)現(xiàn)與激素受體作用相關(guān)的成員。PAK6基因位于人染色體15q14區(qū)，編碼的蛋白質(zhì)為75 kD蛋白質(zhì)。以往研究發(fā)現(xiàn)PAK6在肝癌與前列腺組織中有高表達(dá)，但目前很少有PAK6在膀胱癌組織中的研究。p53基因是細(xì)胞中期中重要的調(diào)節(jié)因子，一般認(rèn)為是參與DNA的修復(fù)和復(fù)制過(guò)程，具調(diào)節(jié)血管生成、促進(jìn)凋亡等作用。Biu-87、T24細(xì)胞均為膀胱癌細(xì)胞，來(lái)源于人膀胱癌；SV-HUC-1細(xì)胞為正常膀胱細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)檢測(cè)膀胱癌患者組織中PAK6、p53表達(dá)以及Biu-87、T24、SV-HUC-1細(xì)胞中PAK6、p53表達(dá)，探討PAK6、p53在膀胱癌組織以及膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)狀況以及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取本院2016年2月至2018年2月診治的膀胱癌患者85例，設(shè)為膀胱組，其中男性67例，女性18例；年齡44～86歲；原發(fā)膀胱癌53例，復(fù)發(fā)膀胱癌32例；取以上患者的膀胱癌組織進(jìn)行研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有入選患者手術(shù)后通過(guò)病理活檢證實(shí)為膀胱癌；②在手術(shù)前均沒(méi)有任何放療、化療、激素治療、免疫治療等；③所有進(jìn)入此研究的患者均簽署過(guò)知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并心、肝、腎等主要器官病變的患者。取35例同時(shí)期行膀胱部分切除或者全部切除的患者，設(shè)為對(duì)照組，男性23例，女性12例；年齡54～70歲；再取其正常的膀胱上皮組織進(jìn)行研究。2組患者的年齡、性別比例等一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。研究中所使用的Biu-87、T24膀胱癌細(xì)胞、SV-HUC-1正常膀胱細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物寶藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，分別為Biu-87組、T24組和SV-HUC-1組。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Biu-87、T24膀胱癌細(xì)胞，用含有5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)SV-HUC-1正常膀胱細(xì)胞，將含有細(xì)胞的培養(yǎng)基放入溫度37 ℃且含有5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育，2～3天后細(xì)胞培養(yǎng)完成可用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)膀胱組與對(duì)照組組織PAK6蛋白陽(yáng)性表達(dá) 膀胱組與對(duì)照組組織用10%甲醛固定，用乙醇脫水，再用石蠟包埋后制作成4 μm厚度的連續(xù)切片，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照。將石蠟切片放入溫度為60 ℃的溫箱中干燥0.5～1 h，再用二甲苯進(jìn)行脫蠟，梯度乙醇進(jìn)行水化。之后用高壓抗原修復(fù)法對(duì)抗原進(jìn)行修復(fù)，內(nèi)源性過(guò)氧化酶阻斷劑浸泡10 min，PBS液沖洗3次，免疫血清封閉10 min，PBS液沖洗3次。后除去PBS加入稀釋過(guò)的一抗，即濃度為1∶200的PAK6/P30，溫度4 ℃下過(guò)夜，PBS沖洗3次；再滴加二抗，即被生物素標(biāo)記過(guò)的羊抗鼠/兔IgG；在室溫下孵育10 min，PBS液沖洗3次；再滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化氫酶，繼續(xù)在室溫下孵育10 min，PBS液沖洗3次；然后滴加新鮮配置的DAB溶液進(jìn)行顯色，用流水沖洗；用蘇木精復(fù)染，再用鹽酸乙醇分化，流水沖洗，用梯度乙醇進(jìn)行脫水干燥，二苯甲透明，中性樹(shù)膠封片。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：每張切片都隨意選取5個(gè)高倍鏡下視野(×400)，分別觀察染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。首先按照染色情況進(jìn)行計(jì)分：無(wú)著色計(jì)分為0，淡黃色計(jì)分為1，棕黃色計(jì)分為2，棕褐色計(jì)分為3。然后按照陽(yáng)性細(xì)胞所占所有細(xì)胞數(shù)量的百分比進(jìn)行計(jì)分：陰性計(jì)分為0，陽(yáng)性細(xì)胞百分比為≤10%計(jì)分為1，百分比>10%～50%計(jì)分為2，>50%～75%計(jì)分為3，>75%則計(jì)分為4。計(jì)算染色強(qiáng)度所計(jì)分和陽(yáng)性細(xì)胞百分率乘積，若得到的值>3分則記為免疫反應(yīng)陽(yáng)性。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)Biu-87組、T24組和SV-HUC-1組PAK6、p53 mRNA表達(dá)水平 取出用6板孔培養(yǎng)好的3組細(xì)胞，沖洗，在每個(gè)孔中加入500 μl Trizol試劑并按照步驟提取出細(xì)胞中的總RNA，并使用分光光度儀檢測(cè)RNA濃度。再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA合成cRNA，根據(jù)合成的模板cRNA對(duì)PAK6及p53基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。引物序列可見(jiàn)表1。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TapⅡ10 μl，模板DNA 2 μl，正向引物0.8 μl，ROX Reference Dye or DyeⅡ0.4 μl，DEPC H2O 6 ml。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 10 s。共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸5 min。反應(yīng)完成后，取5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析

2 結(jié)果

2.1 膀胱組與對(duì)照組組織PAK6、p53陽(yáng)性表達(dá)率的比較

膀胱癌組組織的PAK6蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與對(duì)照組相比較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=29.87，P<0.05)。膀胱癌組組織的p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與對(duì)照組相比較明顯較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.75，P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 2組PAK6、p53陽(yáng)性表達(dá)率比較(例，%)

2.2 膀胱癌組組織中PAK6、p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系

膀胱癌組PAK6蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在腫瘤的數(shù)量、病例分級(jí)、轉(zhuǎn)移情況以及臨床分期方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。膀胱癌組復(fù)發(fā)者PAK6蛋白陽(yáng)性表達(dá)率(28.13%)相對(duì)于原發(fā)者(56.60%)較低(P<0.05)。由數(shù)據(jù)可知，膀胱組單發(fā)者p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于多發(fā)者，病理等級(jí)低者p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于高級(jí)別，臨床分期淺表性癌p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于浸潤(rùn)性，膀胱癌組復(fù)發(fā)者p53蛋白陽(yáng)性的表達(dá)率明顯高于原發(fā)者，膀胱組轉(zhuǎn)移者p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于未轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

表3 膀胱癌組PAK6、p53表達(dá)與臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系(例，%)

2.3 Biu-87組、T24組和SV-HUC-1組細(xì)胞PAK6、p53 mRNA表達(dá)水平的比較

Biu-87組、T24組和SV-HUC-1組3組細(xì)胞PAK6、p53 mRNA的表達(dá)水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.559，P=0.002)。SV-HUC-1組PAK6 mRNA表達(dá)水平(0.44±0.13)高于Biu-87組以及T24組(0.20±0.1、0.12±0.11)(t=13.49，P<0.01；t=17.32，P<0.01)，而B(niǎo)iu-87組PAK6 mRNA表達(dá)水平明顯比T24組高(t=4.96，P<0.01)。SV-HUC-1組p53 mRNA表達(dá)水平(0.36±0.12)低于Biu-87組(0.53±0.21)以及T24組(0.65±0.11)(t=6.48，P<0.01；t=16.42，P<0.01)且Biu-87組p53 mRNA表達(dá)水平明顯比T24組低(t=4.67，P<0.01)。

3 討論

膀胱癌是泌尿系常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率與病死率均居惡性腫瘤的前列，且近些年來(lái)，膀胱癌的發(fā)病率與病死率逐漸升高，主要的發(fā)病年齡在中年后[7]。膀胱癌有易侵襲，復(fù)發(fā)率高，易耐藥等多種特性[8]。PAKs是絲氨酸/蘇氨酸家族之一，在生長(zhǎng)因子信號(hào)中有十分重要的作用，可以引起細(xì)胞骨架重組，并對(duì)遷移和轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子介導(dǎo)產(chǎn)生一定的影響[9-10]。雖然PAKs家族蛋白在癌癥中并不會(huì)發(fā)生突變，但是他們?cè)谝恍┌┌Y中表達(dá)或者擴(kuò)增過(guò)度使其變成對(duì)我們極具吸引力的治療靶點(diǎn)[11]。但是目前在對(duì)PAKs的研究中，很少出現(xiàn)對(duì)PAK6相關(guān)方面的研究。PAK6能夠促進(jìn)部分腫瘤進(jìn)展，具有致瘤性，在原發(fā)性及轉(zhuǎn)移性的前列腺癌中有高表達(dá)，還在去勢(shì)治療后復(fù)發(fā)的患者中有著高表達(dá)[12-13]。在研究中發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌中，PAK6可使雄激素受體的ser-578磷酸化，促進(jìn)雄激素受體-泛素化蛋白連接酶結(jié)合，在雄激素刺激下使得雄激素受體被降解，抑制了雄激素受體和轉(zhuǎn)移[14-16]。同時(shí)，PAK6也可以通過(guò)雄激素受體-泛素化蛋白連接酶的ser-158與ser-186磷酸化，來(lái)調(diào)節(jié)雄激素受體的降解[17]。研究證明，PAK6與雄激素受體表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，PAK6下降則會(huì)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。近年來(lái)有部分研究證明，PAK6在一些癌癥，如前列腺癌、結(jié)腸癌等中為致癌因子，幾乎沒(méi)有文獻(xiàn)研究PAK6在膀胱癌中的表達(dá)情況。而p53基因是與人類腫瘤相關(guān)性較高的抑癌基因，也是研究廣泛的基因之一，他們具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤形成的功能。研究表明，突變型p53基因?qū)?xì)胞凋亡有一定的抑制作用，人體組織中過(guò)量表達(dá)的p53蛋白通常都是由p53基因突變而引起的。突變型p53基因目前已經(jīng)證實(shí)了與多種惡性腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)。

通過(guò)免疫組織化學(xué)法對(duì)膀胱癌患者的膀胱組織和對(duì)照組正常膀胱組織的PAK6蛋白陽(yáng)性表達(dá)率進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)人膀胱癌組織中的PAK6主要定于細(xì)胞質(zhì)，還有少量的PAK6定于細(xì)胞核，而通過(guò)數(shù)據(jù)顯示PAK6在膀胱癌組織中表達(dá)較低，在正常膀胱組織中表達(dá)較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)膀胱癌組PAK6表達(dá)與臨床病理指標(biāo)之間得出膀胱癌組復(fù)發(fā)者的PAK6蛋白陽(yáng)性表達(dá)率(28.13%)相對(duì)于原發(fā)者(56.60%)較低，提示PAK6與膀胱癌的復(fù)發(fā)性有一定的關(guān)系。而在腎透明細(xì)胞癌中，有學(xué)者證明，PAK6低表達(dá)患者預(yù)后不佳，總體存活率與無(wú)復(fù)發(fā)存活率都很低[18-19]。有研究表明，在膀胱癌的發(fā)生和進(jìn)展中雄激素受體信號(hào)通路有十分重要的作用，可能會(huì)與在膀胱癌中的PAK6的作用有十分密切的關(guān)系[20-21]，本研究證明膀胱癌細(xì)胞中PAK6表達(dá)比正常膀胱癌細(xì)胞低，PAK6在膀胱癌發(fā)展的過(guò)程中具有一定的抑瘤作用，但是，其具體的發(fā)生機(jī)制以及對(duì)膀胱癌的預(yù)后影響還有待進(jìn)一步的研究。為避免在上述研究過(guò)程中出現(xiàn)失誤，我們又采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)Biu-87、T24膀胱癌細(xì)胞以及SV-HUC-1正常膀胱細(xì)胞的PAK6 mRNA表達(dá)水平來(lái)驗(yàn)證上面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果得出Biu-87組、T24組細(xì)胞PAK6 mRNA表達(dá)水平均低于SV-HUC-1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果與前面一致，由此可知，PAK6在膀胱癌中為低表達(dá)狀態(tài)，并且與膀胱癌復(fù)發(fā)有很密切的關(guān)系。

膀胱組的p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與對(duì)照組相比較明顯較高，p53在膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)較高，在正常細(xì)胞中表達(dá)較低。并且，由結(jié)果可以看出，p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)與膀胱癌臨床分期、病理分級(jí)等密切相關(guān)，還與膀胱癌的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移有很大的聯(lián)系。正常體細(xì)胞p53基因?yàn)榫幋a53kD的磷酸結(jié)合核蛋白，后者還被稱為野生型p53蛋白，野生型p53蛋白通過(guò)影響基因的轉(zhuǎn)錄，來(lái)干擾DNA起始，促進(jìn)細(xì)胞的終末分化程序化死亡，發(fā)揮其抑制細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化，進(jìn)而組織細(xì)胞癌變。而p53基因突變產(chǎn)物不僅不會(huì)發(fā)揮抑癌作用，而且還會(huì)促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，它的積聚與膀胱癌的分級(jí)、腫瘤增殖與進(jìn)展有密切的聯(lián)系。而我們?cè)跈z測(cè)膀胱癌細(xì)胞中的p53時(shí)，檢測(cè)出的都是突變型p53，而隨著腫瘤程度的上升，p53陽(yáng)性表達(dá)率也會(huì)逐漸上升。為檢驗(yàn)結(jié)果，我們用另外3組細(xì)胞進(jìn)行檢驗(yàn)，Biu-87組、T24組細(xì)胞p53 mRNA表達(dá)率與p53 蛋白表達(dá)率均高于SV-HUC-1組，與上述結(jié)果一致。

綜上所述，PAK6在膀胱癌中表達(dá)異常，與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展有緊密聯(lián)系，并且在膀胱癌的復(fù)發(fā)中有重要作用，PAK6可能會(huì)作為新的抑癌指標(biāo)用以指導(dǎo)臨床。本研究也證明了p53在膀胱癌組織以及膀胱癌細(xì)胞中有高表達(dá)，并且與膀胱癌臨床分期等有密切聯(lián)系，可作為評(píng)估膀胱癌預(yù)后的標(biāo)志物。