miR-26b在肝炎-肝硬化-肝癌疾病進(jìn)展中的表達(dá)

黨 玲 劉媛媛 李 麗 高秀梅

肝癌是指發(fā)生于肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居世界前列[1]。多數(shù)肝癌患者確診時已為中晚期，其5年生存率極低，早期評估肝癌病情及預(yù)后并采取針對性治療是提高其生存率的關(guān)鍵所在[2]。肝癌的發(fā)生是一個多階段的進(jìn)行性發(fā)展過程，不僅受到環(huán)境因素的影響，更是涉及到多個通路的交互作用，其中肝炎與肝硬化存在雙向病程，在早期及時接受診治，可使肝臟組織的功能與結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常；否則會發(fā)展為肝癌，嚴(yán)重情況下會導(dǎo)致患者死亡[3]?，F(xiàn)代研究表明，肝炎形成是由于各種致病因素會損傷肝細(xì)胞，而受損的肝細(xì)胞會激活肝星狀細(xì)胞，被激活的細(xì)胞又會引起表型改變，導(dǎo)致肝竇毛細(xì)血管化及肝內(nèi)病理性血管新生，持續(xù)加重肝纖維化的進(jìn)程[4]。miRNA是一類內(nèi)生的不具備編碼功能的小分子RNA，其能對mRNA的翻譯起到阻礙作用，或是促使靶mRNA被降解，參與細(xì)胞的生長、凋亡、遷移等[5]。已有研究表明，miRNA會通過影響TGF-β等多種細(xì)胞因子或相關(guān)信號通路分子的表達(dá)，進(jìn)而影響肝星狀細(xì)胞的活化狀態(tài)[6]。miR-26家族包括miR-26a、miR-26b和miR-26c，其中miR-26b水平與甲胎蛋白(A-fetoprotein,AFP)關(guān)系密切，而后者可用于肝相關(guān)肝病的診斷和預(yù)后[7]。本文具體分析了miR-26b在肝炎-肝硬化-肝癌疾病進(jìn)展中的表達(dá)意義，以為早期預(yù)防與干預(yù)肝癌提供參考，現(xiàn)總結(jié)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年8月至2019年2月我院收治的50例肝癌患者(肝癌組)、67例肝硬化患者(肝硬化組)與80例肝炎患者(肝炎組)，納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者都明確確診；經(jīng)過本院倫理委員會批準(zhǔn)，本研究相關(guān)患者均簽署了知情同意書；年齡20～70歲；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有轉(zhuǎn)移性肝腫瘤；不配合進(jìn)行檢查者，孕婦及哺乳期婦女；合并其他惡性腫瘤患者。3組患者的性別、年齡、體重指數(shù)、收縮壓、舒張壓等對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。肝癌組中臨床分期Ⅰ期24例，Ⅱ期16例，Ⅲ期10例；組織學(xué)分化：高分化25例，中分化15例，低分化10例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者12例；腫瘤直徑≥5 cm 者14例，<5 cm者 36例。

表1 3組患者一般資料對比

1.2 血miR-26b檢測

取所有患者的外周空腹靜脈血3～5 ml，抗凝后取下層血細(xì)胞。加入裂解液裂解細(xì)胞，采用QIAGEN52100試劑盒提取全血細(xì)胞總RNA，加入60 μl DEPC水溶解沉淀，測定RNA濃度或-80 ℃保存。逆轉(zhuǎn)錄合成miRNA cDNA然后進(jìn)行實時PCR擴(kuò)增，以U6為內(nèi)參基因，實時熒光定量PCR(美國ABI7500)檢測miR-26b表達(dá)水平。20 μl反應(yīng)體系包括：SYBR mix(2×)μl，正向引物0.5 μl，反向引物0.5 μl，探針0.5 μl，DEPC水6.5 μl，cDNA產(chǎn)物2 μl。以上操作均在冰上進(jìn)行，混勻后進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s，40個循環(huán)(95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s)。miR-29a引物(上海英駿生物公司)：5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'。

1.3 調(diào)查內(nèi)容

調(diào)查所有患者的血液學(xué)檢測指標(biāo)，包括AFP、白蛋白(ALB)、膽紅素(TBIL)、谷氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、白細(xì)胞(WBC)、血紅蛋白(Hlb)、血小板(PLT)等。

1.4 統(tǒng)計方法

選擇SPSS 23.00軟件進(jìn)行分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示計量數(shù)據(jù)，以百分比表示計數(shù)數(shù)據(jù)，計量數(shù)據(jù)與計數(shù)數(shù)據(jù)對比采用t檢驗與卡方χ2檢驗，多組間對比采用方差分析，相關(guān)性分析采用直線相關(guān)分析，P<0.05時差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血miR-26b相對含量對比

肝癌組的血miR-26b相對含量為(8.20±0.89)、肝硬化組為(4.89±0.22)、肝炎組為(1.45±0.21)，肝癌組顯著高于肝硬化組(t=25.718、P=0.000)與肝炎組(t=52.719、P=0.000)，肝硬化組也顯著高于肝炎組(t=96.791、P=0.000)。

2.2 血液學(xué)常規(guī)指標(biāo)對比

3組的ALB、BUN、SCr、Hlb值對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，AFP、TBIL、ALT、AST、PLT與WBC值對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組血液學(xué)常規(guī)指標(biāo)對比

2.3 相關(guān)性分析

在肝癌組患者中，直線相關(guān)性分析顯示miR-26b相對含量與AFP、TBIL、ALT、AST、PLT值都有相關(guān)性(P<0.05)。見表3。

表3 肝癌患者miR-26b相對含量與其他血液學(xué)常規(guī)指標(biāo)的相關(guān)性(n=50)

3 討論

肝癌是一種最常見的惡性腫瘤，約80%肝癌患者合并肝炎和肝硬化，其惡性程度極高，早期診斷、早期治療已成為提高肝癌患者生存期的關(guān)鍵[8]。當(dāng)前用于肝癌診斷的腫瘤標(biāo)志物有所增多，理想的肝癌診斷生物標(biāo)志物應(yīng)具備易獲取、創(chuàng)傷小，敏感度和特異度高等特點，但尚無一種公認(rèn)度、特異性、敏感度均較高的可用于評價其病情、療效及預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物[9]。AFP通常僅在發(fā)育期胎兒肝臟中高度表達(dá)，在肝癌中，AFP被重新激活，但只有60%的肝癌患者AFP表達(dá)升高，診斷敏感度和特異度有待提高[10]。miRNA為一類內(nèi)生性非編碼小分子RNA，可作用于多個靶基因，從而參與細(xì)胞的增殖、凋亡等，調(diào)控多種疾病的發(fā)生發(fā)展[11]。當(dāng)前研究表明miRNA在腫瘤組織和患者血液中的水平會發(fā)生不同程度的增高或降低，是潛在的腫瘤診斷及預(yù)后評估指標(biāo)。miR-26由位于7號染色體的基因編碼和轉(zhuǎn)錄，在惡性癌細(xì)胞和組織中表達(dá)上調(diào)，可能具有一定的組織特異性[12]。本研究顯示肝癌組的血miR-26b相對含量顯著高于肝硬化組與肝炎組，肝硬化組也顯著高于肝炎組，表明miR-26b在肝癌中呈現(xiàn)高表達(dá)狀況。

肝癌的形成是由正常的肝黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生病毒感染，形成不同程度的非典型硬化，之后逐漸發(fā)展成原位癌、早期浸潤癌，在這個過程中都涉及到相關(guān)基因的表達(dá)或功能改變[13]。早期發(fā)現(xiàn)并及時給予適當(dāng)?shù)闹委熓翘岣吒伟┛傮w療效的關(guān)鍵。miRNA具有高度保守性、時序性、組織特異性，其可跟靶基因的3'-UTR以完全互補(bǔ)或不完全互補(bǔ)的形式特異性互補(bǔ)，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[14]。近年來，miRNA在腫瘤中作用機(jī)制的研究比較多，肝癌組織中的miRNA在診斷和判斷預(yù)后方面的應(yīng)用價值已得到肯定。有研究顯示miR-26b可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，且與肝癌患者預(yù)后存在關(guān)聯(lián)[15-16]。本研究顯示3組的ALB、BUN、SCr、Hlb值對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，AFP、TBIL、ALT、AST、PLT與WBC值對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；直線相關(guān)性分析顯示肝癌患者的miR-26b相對含量與AFP、TBIL、ALT、AST、PLT值都有相關(guān)性(P<0.05)，表明miR-26b在肝炎-肝硬化-肝癌疾病進(jìn)展中的表達(dá)與患者的病情顯著相關(guān)。不過miR-26b 能否作為臨床肝炎-肝硬化-肝癌疾病的診斷或預(yù)后標(biāo)志物有待于擴(kuò)大樣本量，并與病理分級相結(jié)合進(jìn)一步檢測與觀察。

綜上述所，血miR-26b有望成為新的輔助診斷肝炎-肝硬化-肝癌疾病進(jìn)展的非侵入性指標(biāo)。