EGFR介導(dǎo)的信號(hào)通路影響肺癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移的機(jī)制

傳鋒彬 王 雯 王立宏

在全世界范圍內(nèi)，肺癌是所有惡性腫瘤中死亡率最高的癌癥。臨床上將肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)[1]。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是1種具有酪氨酸激酶活性的膜表面受體，在NSCLC中常發(fā)生突變，是肺腫瘤發(fā)生的原因[2]。最常見(jiàn)的EGFR突變是外顯子19缺失和外顯子21中的p.l858R突變，這些突變可導(dǎo)致EGFR酪氨酸激酶域的過(guò)度激活[3]，進(jìn)而導(dǎo)致肺癌發(fā)生。對(duì)于大多數(shù)肺癌晚期患者而言，常規(guī)順鉑化療僅可使患者的中位生存時(shí)間延長(zhǎng)至8～11個(gè)月[4]。最近，臨床研究表明EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)用于EGFR突變癌癥的治療已非常成功[5]。兩種EGFR-TKIs(吉非替尼和厄洛替尼)仍然是NSCLC患者的一線治療方法[6]，然而隨著EGFR-TKIs的應(yīng)用，患者對(duì)其的耐藥性也迅速發(fā)展[7]。因此，研究EGFR突變型肺癌的詳細(xì)分子機(jī)制對(duì)肺癌的治療非常重要。本研究旨在探討EGFR介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)肺癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移的影響，并分析其潛在的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 肺癌組織采集

收集2017年1月至2019年1月渭南市中心醫(yī)院病理科保存的人NSCLC癌組織的石蠟塊34例，其中17例為EGFR突變肺癌組織。EGFR突變肺癌組織均經(jīng)病理技師采用實(shí)時(shí)定量PCR及基因測(cè)序法對(duì)EGFR外顯子19～21基因突變分析確定。正常肺組織石蠟塊12例，無(wú)EGFR突變組織。所有患者術(shù)前均未接受過(guò)放化療及EGFR-TKI治療等抗腫瘤治療。所有標(biāo)本均用10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋保存。

1.2 免疫組化檢測(cè)肺癌組織中DDX59陽(yáng)性率

采用切片機(jī)將NSCLC癌組織及正常肺組織的石蠟塊切為5 μm厚的薄片，置于載玻片上。經(jīng)二甲苯脫蠟及各級(jí)乙醇脫水后，采用Tris緩沖液(pH 9.0)進(jìn)行抗原熱修復(fù)，然后置于1%過(guò)氧化氫甲醇溶液中30 min使內(nèi)源性過(guò)氧化物酶失活。10%胎牛血清封閉30 min，加入一抗DDX59抗體(1∶50，Santa Cruz)，4 ℃孵育30 min，之后基于DAKO公司的envision試劑盒按照標(biāo)準(zhǔn)化程序采用聚合物放大信號(hào)。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果由2位病理科醫(yī)師盲法做出判定。DDX59陽(yáng)性的判斷標(biāo)準(zhǔn)：DDX59表達(dá)以胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。染色強(qiáng)度評(píng)分：0分為無(wú)色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：0分為陰性，1分為陽(yáng)性細(xì)胞≤10%，2分為陽(yáng)性細(xì)胞10%～50%，3分為陽(yáng)性細(xì)胞50%～75%，4分為陽(yáng)性細(xì)胞≥75%。DDX59陽(yáng)性以染色強(qiáng)度評(píng)分乘以陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分得出的結(jié)果，≥3分為陽(yáng)性，3分為陰性。

1.3 Western Blot檢測(cè)重組EGF對(duì)人正常肺上皮細(xì)胞中DDX59蛋白表達(dá)的影響

人正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，將細(xì)胞培養(yǎng)在含20%胎牛血清和8% DMSO的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。采用100 ng/ml重組EGF(武漢艾美捷科技有限公司)干預(yù)BEAS-2B細(xì)胞0 h、4 h、8 h、12 h后，收獲細(xì)胞，采用Western Blot檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)DDX59蛋白的表達(dá)。另外，采用0 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、400 ng/ml重組EGF干預(yù)BEAS-2B細(xì)胞4 h后，收獲細(xì)胞，采用Western Blot檢測(cè)各濃度梯度DDX59蛋白的表達(dá)。各設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

采用RIPA裂解液從細(xì)胞中提取總蛋白，用BCA試劑盒定量總蛋白。取20 g總蛋白加入上樣緩沖液中，用10%SDS-PAGE凝膠分離總蛋白，之后將總蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%BSA封閉45 min，加入一抗DDX59(1∶200，Santa Cruz)，4 ℃封閉過(guò)夜。加入二抗(1∶10000，上海碧云天)，室溫?fù)u床孵育1 h，采用電化學(xué)發(fā)光試劑ECL在暗室發(fā)光。用Image J軟件統(tǒng)計(jì)分析目的條帶。GAPDH為內(nèi)參。

1.4 Western Blot檢測(cè)MAPK途徑阻斷對(duì)EGFR突變的人肺癌細(xì)胞系H1975中DDX59蛋白表達(dá)的影響

EGFR突變的人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H1975購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，將細(xì)胞培養(yǎng)在含20%胎牛血清和8%DMSO的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。分別采用Ras抑制劑(2.5 M的索拉非尼)、Raf抑制劑(50nM的替吡法尼)、MAPK抑制劑(10 M的PD184352)干預(yù)H1975細(xì)胞24 h，用MEK抑制劑(10 M的U0126)干預(yù)H1975細(xì)胞8 h，之后收獲細(xì)胞，采用Western Blot檢測(cè)經(jīng)不同MAPK途徑阻斷劑處理后H1975細(xì)胞中p-ERK、p-ERK和DDX59蛋白的表達(dá)。用DMSO干預(yù)作為對(duì)照。各設(shè)4個(gè)復(fù)孔。MAPK途徑阻斷劑均購(gòu)自廣州Selleck公司，并根據(jù)Selleck推薦的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行干預(yù)處理。

1.5 MTT法檢測(cè)DDX59抑制對(duì)H1975細(xì)胞增殖活性的影響

慢病毒載體介導(dǎo)的靶向DDX59的shRNA購(gòu)自上海吉?jiǎng)P公司。序列為：人sh-DDX59-1：5'-CCCATTCAAATGCAGATGATT-3'，人sh-DDX59-2：5'-GCGAGCTTTATTCGAGAGCAA'，另合成對(duì)照sh-RNA。用脂質(zhì)體2000將慢病毒介導(dǎo)的sh-DDX59-1、sh-DDX59-2和對(duì)照sh-RNA轉(zhuǎn)染至H1975細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24 h后，收獲細(xì)胞，采用Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

將轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，只加培養(yǎng)液設(shè)為空白孔。培養(yǎng)48 h后每孔加入5 g/l MTT溶液10 μl，37 ℃孵育4 h，離心棄上清，加入150 μl的DMSO。用酶標(biāo)儀在570 nm處檢測(cè)吸光值(A)。細(xì)胞增殖率(%)=A試驗(yàn)孔/A空白孔×100%。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DDX59抑制對(duì)H1975細(xì)胞遷移的影響

將H1975細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于24孔板，形成單層貼壁細(xì)胞，細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)進(jìn)行1.5部分轉(zhuǎn)染。待細(xì)胞長(zhǎng)至100%時(shí)，用200 μl移液器槍頭在單層細(xì)胞上劃痕，此時(shí)記錄0 h時(shí)創(chuàng)面寬度(μm)。孵育24 h后，記錄24 h時(shí)創(chuàng)面寬度(μm)。細(xì)胞遷移率(%)=24 h時(shí)劃痕寬度(μm)/0 h時(shí)劃痕寬度(μm)×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DDX59蛋白在EGFR突變肺癌組織中高表達(dá)

如表1所示，正常肺組織中DDX59陽(yáng)性率為0%(0/12)，肺癌組織為55.9%(19/34)，EGFR突變肺癌組織為70.6%(12/17)，對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.341，P<0.05)。

表1 各組DDX59陽(yáng)性率對(duì)比(例，%)

2.2 EGF對(duì)正常人肺上皮細(xì)胞中DDX59表達(dá)的影響

如圖1所示，與干預(yù)0 h對(duì)比，100 ng/ml的重組EGF干預(yù)正常人肺上皮細(xì)胞4 h、8 h和12 h可顯著增加DDX59蛋白表達(dá)(P<0.05)。與0 ng/ml的重組EGF相比，50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml和400 ng/ml的重組EGF干預(yù)正常人肺上皮細(xì)胞4 h可顯著增加DDX59蛋白表達(dá)(P<0.05)。

注：左圖為不同干預(yù)時(shí)間，右圖為不同作用濃度。

2.3 MAPK途徑阻斷對(duì)EGFR突變的人肺癌細(xì)胞中DDX59表達(dá)的影響

如表2所示，與DMSO對(duì)比，Ras抑制劑、Raf抑制劑、MEK抑制劑和MAPK抑制劑均可顯著降低p-ERK和DDX59的蛋白表達(dá)(P<0.05)，對(duì)ERK蛋白的表達(dá)無(wú)顯著影響。

表2 不同MAPK途徑阻斷劑對(duì)EGFR突變肺癌細(xì)胞中DDX59表達(dá)的影響

2.4 DDX59對(duì)EGFR突變肺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響

如表3所示，與sh-RNA對(duì)比，sh-DDX59-1和sh-DDX59-2可顯著降低DDX59蛋白表達(dá)、細(xì)胞增殖率和細(xì)胞遷移率(P<0.05)。

表3 各組細(xì)胞增殖率及遷移率對(duì)比

3 討論

DDX59屬于DEAD/DEAH盒RNA解旋酶家族，RNA解旋酶可以將ATP水解作用與RNA/DNA構(gòu)象變化進(jìn)行偶聯(lián)，在RNA代謝中發(fā)揮非常重要的作用[8]。之前的報(bào)道顯示DDX59突變參與口面指綜合征的發(fā)病機(jī)制[9]。通過(guò)癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)(www.cbioportal.org)分析發(fā)現(xiàn)DDX59常在人肺癌中表達(dá)上調(diào)，且免疫組織化學(xué)分析證實(shí)DDX59陽(yáng)性表達(dá)占95例總NSCLC患者癌組織近一半左右[10]。此研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)DDX59可通過(guò)促進(jìn)DNA復(fù)制參與肺腫瘤發(fā)生[10]。然而，目前關(guān)于DDX59在肺癌中受到何種調(diào)節(jié)尚未徹底闡明。在本研究中，我們檢測(cè)到55.9%(19/34)的肺癌組織中DDX59高表達(dá)，其中17例EGFR突變肺癌組織中有12例(70.6%)DDX59高表達(dá)，因此我們推測(cè)DDX59高表達(dá)可能與EGFR突變相關(guān)。

為進(jìn)一步證實(shí)上述推測(cè)，我們采用重組EGF體外干預(yù)正常人肺上皮細(xì)胞，采用Western Blot檢測(cè)干預(yù)后DDX59蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示100 ng/ml的重組EGF干預(yù)正常人肺上皮細(xì)胞4 h、8 h和12 h可顯著增加DDX59蛋白表達(dá)，50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml和400 ng/ml的重組EGF干預(yù)正常人肺上皮細(xì)胞4 h可顯著增加DDX59蛋白表達(dá)。這些結(jié)果提示EGF可增加正常肺上皮細(xì)胞中DDX59的表達(dá)，已知EGFR突變導(dǎo)致的酪氨酸激酶域過(guò)度激活是肺癌發(fā)生的原因，因此可以推斷EGF導(dǎo)致的DDX59上調(diào)可能是EGFR突變致癌的分子機(jī)制之一，即DDX59上調(diào)參與EGFR突變導(dǎo)致肺癌發(fā)生的過(guò)程。

DDX59在進(jìn)化上高度保守，其可通過(guò)修飾RNA分子的構(gòu)象從而影響RNA代謝而發(fā)揮作用。很少有研究涉及DDX59在細(xì)胞中的生物化學(xué)作用，其底物特異性和分子機(jī)制也很大程度上未被探索[10]。已知MAPK信號(hào)途徑是EGFR的胞內(nèi)下游信號(hào)通路[11]，本研究也已證實(shí)EGF上調(diào)DDX59，因此我們推測(cè)DDX59和MAPK信號(hào)途徑可能存在相互調(diào)控作用，并且為EGFR的下游信號(hào)通路。為驗(yàn)證此推測(cè)，我們采用MAPK途徑的4個(gè)抑制劑(Ras抑制劑、Raf抑制劑、MEK抑制劑和MAPK抑制劑)干預(yù)EGFR突變的人肺癌細(xì)胞，檢測(cè)這些抑制劑對(duì)DDX59蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示Ras抑制劑、Raf抑制劑、MEK抑制劑和MAPK抑制劑均可顯著降低p-ERK和DDX59的蛋白表達(dá)，表示MAPK途徑抑制可降低DDX59的蛋白表達(dá)，MAPK途徑為DDX59的上游信號(hào)通路，負(fù)責(zé)DDX59的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。為了進(jìn)一步證明DDX59上調(diào)參與EGFR突變導(dǎo)致肺癌發(fā)生的過(guò)程，我們將慢病毒載體介導(dǎo)的靶向DDX59的shRNA轉(zhuǎn)染入EGFR突變的人肺癌細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)sh-DDX59可顯著降低肺癌細(xì)胞的增殖率和遷移率，表明DDX59表達(dá)下調(diào)可抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移，提示DDX59參與EGFR突變的人肺癌發(fā)生過(guò)程。由于腫瘤是高度異質(zhì)的，其他的突變與EGFR突變共存。DDX59也可能受其他癌基因或腫瘤抑制因子的調(diào)控。這可以部分解釋為什么DDX59未能在所有EGFR突變體患者中表達(dá)。

EGFR介導(dǎo)的DDX59蛋白上調(diào)參與肺癌的發(fā)生過(guò)程，DDX59受MAPK途徑的調(diào)控。值得注意的是，除肺癌外，還發(fā)現(xiàn)DDX59基因經(jīng)常在其他類(lèi)型的癌癥中表達(dá)，如乳腺癌、肝癌等。因此DDX59在其他類(lèi)型的癌癥中的作用也值得進(jìn)一步研究，并評(píng)估其在多種人類(lèi)癌癥中的作用。本研究對(duì)DDX59調(diào)節(jié)和功能的研究暗示了這種DEAD盒RNA解旋酶在促進(jìn)癌癥發(fā)展中的潛在重要性及其在肺癌患者中的治療價(jià)值。