發(fā)根農(nóng)桿菌與綠色木霉對玉米幼苗根系生長的影響

王禹佳 武佶 李享

摘要：發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）在促進(jìn)植物根系生長方面具有重要意義，而綠色木霉（Trichoderma viride）在抑制致病菌、促進(jìn)作物生長等方面效果顯著。為探討發(fā)根農(nóng)桿菌和綠色木霉對玉米根系生長的影響，明確二者協(xié)同增效效果及作用機(jī)制，采用盆栽法，設(shè)置發(fā)根農(nóng)桿菌與綠色木霉2類菌株單一、復(fù)合接種作為試驗組，以不施菌劑作為對照，共4組處理。測定接菌后玉米株高、莖粗、葉寬、葉綠素含量、根系指標(biāo)等，探究菌劑單一處理、復(fù)合處理對玉米生長的促進(jìn)效果。結(jié)果表明，菌劑復(fù)合處理與單施發(fā)根農(nóng)桿菌、單施綠色木霉相比玉米生長指標(biāo)明顯提高;單施發(fā)根農(nóng)桿菌、綠色木霉與對照相比根系生長差異明顯，單一施加發(fā)根農(nóng)桿菌、綠色木霉以及混合處理均可以顯著提高玉米植株莖粗和葉綠素含量（SPAD值），但各試驗組間均無顯著性差異。說明3種處理均能促進(jìn)玉米根系生長，但復(fù)合處理對玉米根系生長促進(jìn)作用優(yōu)于發(fā)根農(nóng)桿菌和綠色木霉單一接種，說明玉米植株根系生長過程中二者可以起到協(xié)同促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：發(fā)根農(nóng)桿菌;木霉菌;玉米;根系;促生作用

中圖分類號： S513.01 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）15-0112-06

玉米（Zea mays L.）為禾本科玉蜀黍?qū)僖荒晟鷨巫尤~植物，是典型的高產(chǎn)C4植物[1]，在我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有重要地位[2]，因此玉米品質(zhì)與產(chǎn)量的提高始終是研究的熱點(diǎn)。植物的根系是影響產(chǎn)量的重要器官，根系形態(tài)決定了植物獲得的土地資源，同時也是影響?zhàn)B分吸收的重要因素[3]，進(jìn)而影響植物地上部光合作用與生長發(fā)育[4]，與作物的品質(zhì)和產(chǎn)量息息相關(guān)。玉米作為單株生產(chǎn)力較強(qiáng)的禾谷類作物，其強(qiáng)大的根系是成為高產(chǎn)作物的重要原因之一[5]。改變玉米根系特征促進(jìn)作物生長是直接且有效的方法，目前許多栽培手段都是通過直接影響作物根系來實(shí)現(xiàn)作物高產(chǎn)的[6]。2005年徐洪偉等首次利用發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）侵染非天然寄主的單子葉植物玉米，成功培養(yǎng)了1種玉米新種質(zhì)材料——玉米毛狀根再生植株，其根系龐大且構(gòu)型復(fù)雜，有利于吸收土壤中的水分和養(yǎng)分，從而使玉米獲得較高產(chǎn)量[7]。劉愛榮等研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌（Trichoderma spp.）可以促進(jìn)根系發(fā)育提高作物產(chǎn)量，也能在一定程度上抵抗生物與非生物脅迫[8]。木霉菌主要的促生機(jī)制包括分泌類植物激素丁烯羥酸內(nèi)酯以刺激作物根系伸長和活化土壤中的難溶養(yǎng)分磷、鐵等元素[9]。前人研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌株可以顯著提高馬鞭草產(chǎn)量，同樣也可以促進(jìn)番茄、豆類、黃瓜等農(nóng)作物的生長[10]。2009年Metwally等研究證明，木霉菌可以改善洋蔥的生長參數(shù)，如鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、根、莖、葉面積以及葉綠素含量等[11]。Shahid等研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌處理綠豆可使其產(chǎn)量提高29%[12]?？梢娔久咕鳛橐环N新型的生物促生劑，在生物防治與促進(jìn)植物生長方面具有廣闊的應(yīng)用前景。但由于環(huán)境與植物本身的影響，木霉菌單獨(dú)使用時生存能力和定殖能力較弱[13]，木霉菌通過定殖于根系外表皮，形成無毒的植物-木霉菌共生體調(diào)節(jié)植物新陳代謝實(shí)現(xiàn)促進(jìn)作物生長[8]。目前已經(jīng)證實(shí)發(fā)根農(nóng)桿菌可有效促進(jìn)玉米根系生長，但前人研究多集中于單一菌種的抗病或促生方面的作用[14-20]，而兩者同時接種協(xié)同促進(jìn)玉米植株生長的研究鮮有報道。本試驗以玉米為研究對象，利用發(fā)根農(nóng)桿菌、綠色木霉菌單一及復(fù)合接種，探究其對玉米幼苗根系生長的影響，以及二者能否發(fā)揮協(xié)同作用促進(jìn)玉米植株根系生長，以期為高效生物有機(jī)肥的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

植物材料：玉米鄭單958，由筆者所在實(shí)驗室保存。

供試菌株：綠色木霉菌（Trichoderma viride），由筆者所在實(shí)驗室保存，分離于四年生大田人參根部，該人參取自吉林省臨江市四道溝鎮(zhèn)崗頭村，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）產(chǎn)物送至北科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，將測得序列片段于美國國家生物信息中心（NCBI）網(wǎng)站進(jìn)行基于局部比對搜索工具（BLAST）比對，確認(rèn)為綠色木霉。發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834，由法國國家科學(xué)院生物技術(shù)與園藝研究中心Tepter博士惠贈[7]。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖（PD）培養(yǎng)液、LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基。

供試土壤：土壤取自梨樹試驗田，土質(zhì)為黑土，經(jīng)立式壓力蒸汽滅菌器于121 ℃、0.22 MPa條件下滅菌 2 h，自然冷卻備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌劑制備 發(fā)根農(nóng)桿菌發(fā)酵液制備：將保存于-80 ℃超低溫冰箱中的發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834于LB固體平板中劃線培養(yǎng)，置于28 ℃暗培養(yǎng)2 d后挑取單菌落轉(zhuǎn)入5 mL LB液體培養(yǎng)基中，于 26.8 ℃、166 r/min 暗培養(yǎng)活化24 h后，吸取0.5～1.0 mL菌液轉(zhuǎn)入50 mL LB液體培養(yǎng)基中，于 26.8 ℃、166 r/min 黑暗振蕩培養(yǎng)，反復(fù)進(jìn)行3次活化，菌液在600 nm處的吸光度（D600 nm）為0.4～0.6。

綠色木霉發(fā)酵液制備：將綠色木霉接種于PDA培養(yǎng)基中，于28 ℃活化培養(yǎng)3～5 d產(chǎn)生綠色分生孢子，用無菌水沖洗分生孢子，使用血球計數(shù)板調(diào)節(jié)孢子濃度為5.0×108 CFU/mL，將分生孢子液按照5%的接種量轉(zhuǎn)接入裝有100 mL PD培養(yǎng)液的250 mL三角燒瓶，于 28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)3 d制成木霉菌發(fā)酵液，備用。

1.2.2 盆栽試驗 試驗于2019年5—7月在吉林省植物資源科學(xué)與綠色生產(chǎn)重點(diǎn)實(shí)驗室內(nèi)進(jìn)行，取滅菌后的試驗土裝入塑料育苗盆（規(guī)格：28 cm×25 cm），每盆裝土2 kg，加入已活化的菌液150 mL，混勻后待用。試驗設(shè)置4個處理（對照，CK;單一發(fā)根農(nóng)桿菌拌土處理，T1;單一綠色木霉拌土處理，T2;50%發(fā)根農(nóng)桿菌+50%綠色木霉菌混合拌土處理，T3），每個處理均設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。播種前于45 ℃溫水中浸泡玉米種子8 h，浸泡后種子洗凈，用濾紙吸干表面多余水分，均勻地放置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿上，保持濾紙濕潤，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng) 24 h。選取大小一致的露白玉米種子，每盆播種4穴，每穴2粒，待玉米植株2葉期時定植，每盆4株。生長期間正常澆水，使土壤基本保持濕潤狀態(tài)。

1.2.3 測定指標(biāo)與方法 于玉米植株4葉1心期時測定以下指標(biāo)：（1）莖粗：子葉節(jié)下1 cm處粗度，用游標(biāo)卡尺測定;（2）葉寬、株高，用直尺測定;（3）葉綠素含量（SPAD值）的測定：選擇生長狀態(tài)良好且長勢一致的玉米植株，清除葉片表面塵土，每張葉片的相同位置選取6個測量點(diǎn)，采用 TYS-A型葉綠素測定儀測定葉片的葉綠素含量（SPAD值），記錄的數(shù)據(jù)取平均值;（4）根系形態(tài)學(xué)指標(biāo)的測定：將洗凈的玉米根系放入20 cm×40 cm的根盤中置于掃描儀上，在根盤中添加高度為5～10 mm的水，使水面恰好全部沒過根系，用儀器遮光板全部覆蓋住根盤，進(jìn)行根系全景掃描。待掃描完成，通過Win RHIZO圖像查看軟件，調(diào)節(jié)閾值使效果最佳，獲得如下指標(biāo)：總投影面積、總根長、總根表面積、平均根系直徑、根尖數(shù)、分枝數(shù)、交叉數(shù)、總根體積等。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 用Excel處理試驗數(shù)據(jù)、作圖，利用SPSS 22.0軟件中最小顯著差異法（least significant difference，LSD）對數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較（P<0.05）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)根農(nóng)桿菌、綠色木霉菌處理對玉米地上部植物學(xué)性狀的影響

從圖1可以看出，發(fā)根農(nóng)桿菌、綠色木霉單一接種、混合接種對玉米幼苗莖部和葉片發(fā)育均有促進(jìn)作用。施加發(fā)根農(nóng)桿菌處理（T1）的玉米植株莖粗、葉綠素含量都顯著高于對照處理（P<0.05），分別提高41.1%、88.2%（圖1-A、 圖1-D）;株高和葉寬雖與對照差異不顯著，但趨勢一致，分別提高22.6%、18.0%（圖1-C、圖1-B）。施加綠色木霉處理（T2）與對照組相比葉寬沒有顯著提高，但株高（圖1-C）、莖粗（圖1-A）、SPAD值（圖1-D）顯著提高，分別提高28.4%、42.8%、60.6%。施加發(fā)根農(nóng)桿菌和綠色木霉復(fù)合處理（T3）莖粗、SPAD值與對照差異顯著，分別提高38.6%、63.7%（圖1-A、圖1-D），株高、葉寬與對照差異不顯著，但均高于對照（圖1-B。圖1-C）。

葉綠素含量反映植株光合速率跟碳水化合物累積的關(guān)系，葉綠素含量與植株對光能的利用效率呈正相關(guān)關(guān)系[21]。表1結(jié)果顯示，3種處理SPAD值均顯著高于對照組，說明施加發(fā)根農(nóng)桿菌、綠色木霉、發(fā)根農(nóng)桿菌和綠色木霉聯(lián)合施用處理均可促進(jìn)玉米植株的光合作用，有利于化合物的積累。從莖粗來看，與CK相比試驗組對玉米幼苗橫向生長發(fā)育具有顯著的促進(jìn)作用，表明3種處理均可顯著提高玉米幼苗莖部素質(zhì)，進(jìn)而利于提高植株健壯程度。

2.2 發(fā)根農(nóng)桿菌、綠色木霉菌處理對玉米根系吸收范圍的影響

根是影響植物產(chǎn)量的重要器官[22]，根形態(tài)決定了植物可獲得的土地資源，好的根系形態(tài)有利于土壤養(yǎng)分的吸收[23]。根表面積和根總投影面積反映植物與土壤的接觸面，與根系吸收水分、養(yǎng)分含量和吸收能力息息相關(guān)[24]。由表2可知，與對照相比，施加發(fā)根農(nóng)桿菌玉米植株總根表面積顯著增加29.6%，總投影面積比對照大但差異不顯著;施加綠色木霉玉米植株總根表面積顯著提高47.4%;施加發(fā)根農(nóng)桿菌、綠色木霉復(fù)合處理比單獨(dú)施加發(fā)根農(nóng)桿菌根系增長效果更好，總根表面積和總投影面積分別提高22.3%、16.5%（圖2），說明綠色木霉可能具有協(xié)助發(fā)根農(nóng)桿菌發(fā)揮作用促進(jìn)植株根系吸收面積增大的作用。

根長可反映根系的延伸范圍，根系的縱向擴(kuò)展延伸有利于植物吸收深層土壤的水分和養(yǎng)分，總根體積可反映植株根系健壯程度[25]，發(fā)達(dá)而健壯的根系是作物高產(chǎn)的基礎(chǔ)。如圖3所示，與對照相比，施加發(fā)根農(nóng)桿菌玉米植株的總根長、總根體積差異不顯著，分別提高34.7%、45.9%;施加綠色木霉玉米植株總根長提高74.0%，總根體積增長1.65倍，且顯著高于對照;施加發(fā)根農(nóng)桿菌和綠色木霉復(fù)合處理比單獨(dú)施加發(fā)根農(nóng)桿菌處理增長效果更好，總根長顯著提高43.1%，總根體積顯著提高250.4%。

結(jié)果表明，單獨(dú)施加發(fā)根農(nóng)桿菌、綠色木霉和混合接種都能夠促進(jìn)玉米幼苗的根系生長，增加根長、總根體積、總根表面積，促進(jìn)根系橫向增粗和縱向伸長，擴(kuò)大根系吸收面積范圍，其中發(fā)根農(nóng)桿菌和綠色木霉復(fù)合處理效果最佳。

2.3 發(fā)根農(nóng)桿菌、綠色木霉菌處理對玉米根系吸收功效的影響

根系交叉數(shù)、分枝數(shù)、根尖數(shù)反映了植物根系吸收能力的強(qiáng)弱[24]，而根系直徑可反映植物根系總吸收功效，與植株對土壤水分和養(yǎng)分的吸收能力息息相關(guān)[26]。如圖4所示，單獨(dú)施加發(fā)根農(nóng)桿菌玉米和施加綠色木霉玉米植株根尖數(shù)、交叉數(shù)、分枝數(shù)、平均根系直徑與對照均無顯著性差異，但比對照高;發(fā)根農(nóng)桿菌、綠色木霉復(fù)合處理玉米植株比單獨(dú)施加發(fā)根農(nóng)桿菌增效更佳，根尖數(shù)、交叉數(shù)、分枝數(shù)、平均根系直徑分別增長83.8%、86.4%、67.5%、142.5%。結(jié)果表明，單一施加發(fā)根農(nóng)桿菌、綠色木霉和混合接種都能夠提高植株根系吸收能力，但發(fā)根農(nóng)桿菌和綠色木霉復(fù)合處理效果最佳。

3 討論

3.1 施加單一菌劑對玉米地上部生長的促進(jìn)作用

木霉菌用于無病原體的土壤，會引起幼苗出苗率、株高、干質(zhì)量的增加[27-28]。Samantha等分離鑒定的木霉菌株可使植物葉綠素含量增加6.8%，植物生物量增加4.5%，且植株根系顯著發(fā)育[29]，本試驗結(jié)果與之一致。結(jié)果顯示，施加發(fā)根農(nóng)桿菌處理的玉米植株莖粗、葉綠素含量分別提高41.1%、88.2%，顯著高于對照組，株高和葉寬雖與對照差異不顯著，但分別提高22.6%、18.0%。施加綠色木霉處理與對照組相比，株高、莖粗、SPAD值顯著提高， 分別提高28.4%、42.8%、60.6%。說明單一施加2種菌劑均可顯著促進(jìn)玉米植株地上部的生長。

3.2 施加單一菌劑對玉米根系吸收能力的促進(jìn)作用

玉米根系是作物吸收水分和養(yǎng)分的主要器官，前人研究認(rèn)為，增加玉米苗期根長，擴(kuò)大根系體積、根系吸收表面積，有利于根系對營養(yǎng)的吸收利用[22]。Yedidia等在黃瓜播種后28 d施加木霉菌T203，使黃瓜植株根體積、植株干質(zhì)量分別增加95%、80%[30]。褚長彬等研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)木霉發(fā)酵液處理的綠豆插條不定根提早2 d出現(xiàn)，并且在根數(shù)、根長、根生物量等方面都優(yōu)于對照[31]。本試驗發(fā)現(xiàn)，與對照相比，施加發(fā)根農(nóng)桿菌總根表面積顯著增加29.6%，總投影面積、總根長、總根體積、根尖數(shù)、交叉數(shù)、分枝數(shù)、平均根系直徑均高于對照且增幅較大;施加綠色木霉玉米植株根系表面積、總根長、總根體積顯著高于對照，總投影面積、根尖數(shù)、交叉數(shù)、分枝數(shù)和平均根系直徑與對照差異不顯著但均遠(yuǎn)高于對照，結(jié)果表明施加發(fā)根農(nóng)桿菌和施加綠色木霉可以明顯促進(jìn)玉米根系對水分和養(yǎng)分的吸收能力。

3.3 綠色木霉與發(fā)根農(nóng)桿菌的協(xié)同增效作用

研究發(fā)現(xiàn)，施加發(fā)根農(nóng)桿菌和綠色木霉復(fù)合處理與單獨(dú)施加發(fā)根農(nóng)桿菌處理對玉米地上部植物學(xué)性狀的影響無顯著性差異;但對玉米根系增長的影響存在顯著性差異，復(fù)合處理總根表面積和總投影面積分別比單施發(fā)根農(nóng)桿菌提高22.3%、16.5%;施加發(fā)根農(nóng)桿菌和綠色木霉復(fù)合處理與施加發(fā)根農(nóng)桿菌處理相比，玉米植株總根長顯著提高43.1%，總根體積顯著提高250.4%，說明綠色木霉可能具有協(xié)助發(fā)根農(nóng)桿菌發(fā)揮作用增大玉米植株根系吸收面積的作用。施加發(fā)根農(nóng)桿菌和綠色木霉復(fù)合處理玉米植株與施加發(fā)根農(nóng)桿菌相比，玉米植株根尖數(shù)、交叉數(shù)、分枝數(shù)和平均根系直徑分別增長41.2%、87.2%、73.7%、142.5%。說明綠色木霉和發(fā)根農(nóng)桿菌對玉米根系吸收功效的提高存在增效作用，其機(jī)制目前仍在研究中。

4 結(jié)論

單一施加發(fā)根農(nóng)桿菌與綠色木霉可以通過提高玉米莖部素質(zhì)、增大植株根系增強(qiáng)玉米植株健壯程度、增加作物養(yǎng)分吸收范圍、促進(jìn)植株生長，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)提高作物產(chǎn)量的目的。

混合施加發(fā)根農(nóng)桿菌和綠色木霉可以發(fā)揮協(xié)同作用促進(jìn)玉米植株根系生長，且與施加單一菌劑差異明顯，說明綠色木霉對發(fā)根農(nóng)桿菌存在增效作用。本試驗結(jié)果為生物有機(jī)肥的后期開發(fā)與研究提供了理論基礎(chǔ)，對綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。

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