bFGF轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對新生骨成熟過程的生物力學(xué)影響—兔脛骨延長模型研究

劉增運，任志勇，湯麗國，楊躍，王輝，霍繼貞

（1.山東陽光融和醫(yī)院 骨科，山東 濰坊 262100；2.中國人民解放軍陸軍第80集團(tuán)軍醫(yī)院 創(chuàng)傷骨二科，山東 濰坊 261021）

1 材料與方法

1.1 材料

純種新西蘭大白兔共48只，均為雄性，體重3.0～3.5 kg，由陸軍第80集團(tuán)軍醫(yī)院實驗室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞模型的制備

將新西蘭兔麻醉，取脛骨分離間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)傳代6代以上獲得純度較高的間充質(zhì)干細(xì)胞；后將bFGF基因轉(zhuǎn)染修飾獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞使其基因高表達(dá)。

1.2.2 動物模型的分組及建立

首先將實驗動物行常規(guī)術(shù)前準(zhǔn)備，在左小腿前內(nèi)側(cè)分離肌肉，充分顯露整條脛骨，縱行切開骨膜并進(jìn)行剝離，在脛腓骨結(jié)合平面以下以細(xì)線鋸橫行截斷脛骨，生理鹽水充分沖洗傷口，并進(jìn)行骨干復(fù)位，安裝人掌骨延長外固定架，依次縫合骨膜、皮下組織、皮膚。按體重相同或相近將48只實驗動物分為16個區(qū)組，再將每個區(qū)組中的3個受試對象隨機(jī)分配到3個處理組。實驗組于延長結(jié)束后向牽張間隙內(nèi)注入200 μL bFGF轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，將相同濃度骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞注入作為對照組，空白組不注入任何物質(zhì)。

術(shù)后第6、12周時每組分別取8只實驗動物，周圍正常骨組織標(biāo)本作為對照。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 影像學(xué)檢查

術(shù)后第12周拍攝脛骨正位片（管球電壓15 kv，曝光時間1 s）。應(yīng)用lmage J圖像分析軟件測量新生骨的灰度值和面積，及正常骨的灰度值，所得比值為相對灰度(%)。

1.3.2 HE染色

宜興市秸桿還田方式主要為套播麥秸稈覆蓋還田和稻秸稈切碎勻鋪后進(jìn)行播種，然后采用旋耕開溝一體機(jī)作業(yè)兩種方式。在播種季節(jié)寬余、土壤墑情適宜、天氣條件允許的情況下，可采用水稻收獲秸稈切碎勻鋪后，進(jìn)行施肥、播種，有利于控制播量，均勻播種。然后利用旋耕—開溝一體機(jī)進(jìn)行淺旋耕滅茬、開溝，可起到種、肥、草、泥混合，并消滅露籽的效果。

術(shù)后第6周觀察各組牽張成骨區(qū)炎性細(xì)胞及破骨細(xì)胞情況；術(shù)后第12周檢測各組牽張成骨區(qū)骨形成、鈣鹽沉積及骨細(xì)胞生長情況。

1.3.3 骨密度(BMD)測定

術(shù)后12周每組取8只兔麻醉后留取骨標(biāo)本，測定骨密度，我們選取骨折處的骨密度與該骨正常處的骨密度比值作為測量指標(biāo)。

1.3.4 生物力學(xué)測試

取兔兩側(cè)的脛骨做生物力學(xué)測試，骨密度測定完成后，用CSS-4000萬能材料測試儀進(jìn)行生物力學(xué)測試。取兔脛骨手術(shù)側(cè)/非手術(shù)側(cè)比值作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)，以此排除了個體差異。

2 結(jié)果

2.1 影像學(xué)結(jié)果分析

各組在固定期第12周拍正位X線片，應(yīng)用Image J分析新生骨的面積和灰度值，同時測量該段骨上某一固定位置的正常骨灰度值，它們的比值為相對灰度(%)，行方差分析，然后行兩兩組間配對t檢驗，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，各組間面積比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

表1 12周X線片骨灰度值結(jié)果分析（±s）

表1 12周X線片骨灰度值結(jié)果分析（±s）

相對灰度值（%）實驗組 9 3.3 0 8±5.0 0 3對照組 7 8.4 3 2±6.5 3 1空白組 7 4.8 6 2±6.0 0 3

2.2 HE染色觀察新生骨情況

各組兔于固定期第6周留取標(biāo)本：對照組及空白組可見大量炎性細(xì)胞浸潤，破骨細(xì)胞減少，基本無骨痂形成；實驗組可見炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，破骨細(xì)胞減少，纖維軟骨骨痂形成（圖1）。

圖1 各組固定期第6周牽張間隙新生骨組織（HE染色×100）

術(shù)后第12周：與空白組及對照組相比，實驗組骨性骨痂明顯增多，可見均勻鈣鹽沉積，肥大骨細(xì)胞形成（圖 2）。

圖2 各組固定期第12周牽張間隙新生骨組織（HE染色×100）

2.3 骨密度值測定

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計程序行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗組與對照組、空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），對照組與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，表 2）。

表2 12周BMD結(jié)果分析（±s）

表2 12周BMD結(jié)果分析（±s）

BMD相對值（%）實驗組 48.2±21.3對照組 29.8±20.5空白組 27.5±20.2

2.4 生物力學(xué)測定結(jié)果分析

生物力學(xué)測定各項指標(biāo)采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗組與其他兩組在扭轉(zhuǎn)強(qiáng)度、扭力、破裂能三個測試指標(biāo)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組與空白組比較差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；各組處理因素對扭轉(zhuǎn)角測試無明顯影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，表3)。

表3 12周生物力學(xué)結(jié)果分析（±s）

表3 12周生物力學(xué)結(jié)果分析（±s）

扭轉(zhuǎn)強(qiáng)度（MPa） 扭力(N) 扭轉(zhuǎn)角(°) 破裂能實驗組 89.1±4.5 75.2±1.9 83.4±3.4 63.4± 2.1對照組 78.8±7.1 63.4±3.7 82.1±3.1 52.1± 3.5空白組 64.7±5.6 53.7±8.1 80.7±7.3 43.9±10.3

3 討論

Ilizarov技術(shù)用于解決骨髓炎、骨折后不愈合以及先天性脛骨假關(guān)節(jié)等十三個方面創(chuàng)傷及矯形方向的問題[3]。該技術(shù)自20世紀(jì)80年代后陸續(xù)傳入世界各國，隨著世界各國醫(yī)療專家對Ilizarov外固定架的不斷改造及升級，這門技術(shù)再次在創(chuàng)傷、矯形等相關(guān)學(xué)科煥發(fā)出青春[4]。

bFGF大小約17 KD，由155個氨基酸殘基組成，存在于多種動物體內(nèi)，主要分布于動物的垂體組織內(nèi)。研究已證實bFGF主要的作用包括：顯著促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化，并且對血腦屏障起保護(hù)作用；與肝素聯(lián)合應(yīng)用顯著促進(jìn)燙傷創(chuàng)面的修復(fù)能力，縮短治療時間；作為體外枝接支架應(yīng)用于組織修復(fù)再生；促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化等重要的作用[5-7]。本實驗通過對相對灰度、HE染色、骨密度測定、生物力學(xué)測試四個檢測指標(biāo)進(jìn)行測試，最終結(jié)果均證實實驗組牽張區(qū)的成骨質(zhì)量明顯優(yōu)于對照組及空白組?？傊搶嶒炦M(jìn)一步證實了經(jīng)bFGF基因轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可通過分泌bFGF對延長區(qū)成骨質(zhì)量起到了明顯的促進(jìn)作用[8-10]。但與其他生長誘導(dǎo)物質(zhì)的聯(lián)合作用機(jī)制及作用效果，還需要作進(jìn)一步研究。