人參皂苷Rg1對阿霉素引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用及機(jī)制研究

馬鉑涵，韓兵，劉婷，王一，黃建華，陶貴周

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000；2.青島市即墨區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，山東 青島 266200）

阿霉素是一種抗腫瘤抗生素，抗瘤譜較廣，對乳腺癌等腫瘤有一定療效?？墒牵⒚顾鼐哂性S多副作用，最明顯的為心臟毒性[1-2]。阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的主要特征是心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species,ROS）引起的細(xì)胞凋亡[3-4]。目前關(guān)于阿霉素可引起心臟毒性的研究側(cè)重于心肌細(xì)胞在阿霉素?fù)p傷心臟中的作用，而對血管內(nèi)皮細(xì)胞在阿霉素?fù)p傷心臟中的作用研究較少。近來研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞在阿霉素?fù)p傷心臟中起重要作用[5]。有文獻(xiàn)報道人參皂苷Rg1 對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用[6-7]。近期研究發(fā)現(xiàn)Rg1 可以防止阿霉素引起的心臟毒性[8]。提示Rg1 除了保護(hù)心肌細(xì)胞外，還可能通過保護(hù)心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞從而防止阿霉素對心臟產(chǎn)生的損傷。本實驗通過體外阿霉素?fù)p傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，觀察人參皂苷Rg1 對阿霉素?fù)p傷后的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、小管形成、凋亡及ROS 的影響，并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein vascular endothelial cells,HUVECs）購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。人參皂苷Rg1 購自南京景竹生物科技有限公司，阿霉素購自美國APExBIO 公司，DMEM-F12培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司，胎牛血清購自美國CLARK Bioscience 公司，胰酶購自加拿大Gibco 公司，Matrigel 購自美國BD 公司，Annexin V-FITC/PI 購自北京四正柏公司，Hochst33342、NO 熒光指示染料DAF-FM DA、超氧化物陰離子熒光探針及MTT 購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，p-Akt、Akt、Bcl-2、p-ERK、ERK、p-eNOS、eNOS、Actin 及二抗均購自美國CST 公司。

1.2 分組

本研究分為正常組（未做任何處理）、阿霉素組（0.5μg/ml）、阿霉素+Rg1 組（0.5μg/ml 阿霉素+200μg/ml Rg1），阿霉素的用藥劑量及作用時間點(diǎn)均參考LORENZO 等[9]的方法。

1.3 MTT 法

待HUVECs 生長至90%～95%豐度時，消化、計數(shù)接種于96 孔板中（5 000 個/孔）。各組藥物處理48 h 后行MTT 法檢測，觀察人參皂苷Rg1 對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。

1.4 劃痕實驗

將消化、計數(shù)的HUVECs 按照4.0×105個/孔接種于6 孔板中，待細(xì)胞生長至90%～95%豐度時，用200μl 槍頭在培養(yǎng)皿底垂直劃一道痕，輕輕吸去細(xì)胞碎片及培養(yǎng)基，PBS 沖洗1 遍。分別在藥物處理0、48 h 后用倒置顯微鏡拍照觀察人參皂苷Rg1 對血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響。

1.5 小管形成實驗

提前一晚將小管形成實驗所需的Matrigel 基質(zhì)膠、24 孔板、200μl 槍頭放置于4℃冰箱過夜備用。次日，取200μl Matrigel 基質(zhì)膠緩慢鋪于24 孔板中（防止產(chǎn)生氣泡），放置培養(yǎng)箱中孵育30 min 后，每孔加入1.0×105個HUVECs 和1 000μl 完全培養(yǎng)基。在37℃、5%二氧化碳條件下孵育6 ～8 h，用倒置顯微鏡進(jìn)行跟蹤拍照，觀察人參皂苷Rg1 對血管內(nèi)皮細(xì)胞小管形成的影響。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)

將HUVECs 按4.0×105個/孔接種于6 孔板中，藥物處理48 h 后進(jìn)行Hochst33342 染色，觀察人參皂苷Rg1 對阿霉素引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。為進(jìn)一步明確人參皂苷Rg1 對阿霉素引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，消化并收集血管內(nèi)皮細(xì)胞（5.0×105個/孔），重懸后進(jìn)行Annexin V-FITC/PI 染色，用流式細(xì)胞儀檢測人參皂苷Rg1 對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。

1.7 NO 及ROS 檢測

將HUVECs 按4.0×105個/孔接種于6 孔板中，藥物處理48 h 后進(jìn)行NO 和ROS 檢測。檢測NO 時，將HUVECs 加入含DAF-FMDA（5μmol/L）的溶液，在室溫下孵育30 min。檢測ROS 時，將HUVECs 加入含超氧化物陰離子熒光探針（5μmoL/L）的溶液，室溫下孵育30 min，在倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.8 Western blotting 檢測

將培養(yǎng)的HUVECs 用藥物處理48 h 后，收取細(xì)胞并提取蛋白，進(jìn)行BCA 蛋白定量及制樣。依據(jù)不同目的蛋白分別配置10%或12% SDS-PAGE，PVDF 膜轉(zhuǎn)膜，洗膜液清洗1 次，5 min/次，封閉2 h，分別加入Bcl-2、ERK、p-ERK、Akt、p-Akt、eNOS 及p-eNOS一抗4℃孵育過夜，次日洗膜液清洗3 次，5 min/次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，洗膜液清洗3 次，5 min/次，加入化學(xué)發(fā)光液曝光顯影，觀察人參皂苷Rg1 對凋亡通路及p-Akt/p-eNOS 信號通路的影響。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg1 提高阿霉素?fù)p傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性

MTT 法結(jié)果顯示，正常組、阿霉素組和阿霉素+Rg1組細(xì)胞活性分別為（100.00±0.00）%、（37.89±6.17）%和（56.51±7.23）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=179.649，P=0.000）。與正常組比較，阿霉素組細(xì)胞活性降低（P＜0.05）；與阿霉素組比較，阿霉素+Rg1 組能提高血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性（P＜0.05）。見圖1。

圖1 人參皂苷Rg1 對阿霉素?fù)p傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響 （±s）

2.2 人參皂苷Rg1 改善阿霉素?fù)p傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移及小管形成狀態(tài)

各組細(xì)胞遷移率、血管形成交叉點(diǎn)數(shù)比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，阿霉素組細(xì)胞遷移率、血管形成交叉點(diǎn)數(shù)降低（P＜0.05）；與阿霉素組比較，阿霉素+Rg1 組能夠改善受損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及小管形成狀態(tài)（P＜0.05）。見表1和圖2、3。

表1 各組細(xì)胞遷移率、血管形成交叉點(diǎn)數(shù)比較 （±s）

表1 各組細(xì)胞遷移率、血管形成交叉點(diǎn)數(shù)比較 （±s）

注： ①與正常組比較，P ＜0.05；②與阿霉素組比較，P ＜0.05。

組別 遷移率/% 血管形成交叉點(diǎn)數(shù)正常組 81.598±4.416 122.600±10.615阿霉素組 49.211±3.181① 46.800±5.973①阿霉素+Rg1 組 72.132±6.655② 108.200±7.302②F 值 103.463 144.003 P 值 0.000 0.000

圖2 人參皂苷Rg1 對阿霉素?fù)p傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響 （×40）

圖3 人參皂苷Rg1 對阿霉素?fù)p傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞小管形成的影響 （×40）

2.3 人參皂苷Rg1 減少阿霉素?fù)p傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡

Hochst33342 染色顯示，藥物作用48 h 后，正常組細(xì)胞核呈淺藍(lán)色；阿霉素組細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮并分裂，明顯發(fā)亮；阿霉素+Rg1 組相對于阿霉素組，亮藍(lán)色斑點(diǎn)明顯減少。提示人參皂苷Rg1 對阿霉素?fù)p傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡有保護(hù)作用。見圖4。

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，正常組、阿霉素組和阿霉素+Rg1 組細(xì)胞凋亡率分別為（2.16±0.36）%、（17.07±1.30）%和（6.65±0.47）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=259.132，P=0.000）。與阿霉素組比較，阿霉素+Rg1 組減少阿霉素引起的細(xì)胞凋亡（P＜0.05）。見圖5、6。

2.4 人參皂苷Rg1 對阿霉素?fù)p傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS 及NO 水平的影響

圖4 人參皂苷Rg1 對阿霉素?fù)p傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞的Hochst33342 染色結(jié)果 （×200）

圖5 人參皂苷Rg1 對阿霉素?fù)p傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

圖6 各組細(xì)胞凋亡率比較 （±s）

DAF-FMDA 是一種NO 定量檢測的熒光探針，NO 含量越高綠色熒光表達(dá)越強(qiáng)。超氧化物陰離子熒光探針是最常用的檢測細(xì)胞內(nèi)超氧化物陰離子水平的熒光探針，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的超氧化物陰離子水平較高時，紅色熒光較強(qiáng)，反之則較弱。各組藥物處理48 h 后NO 及ROS 平均熒光強(qiáng)度比值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與阿霉素組比較，阿霉素+Rg1 組阿霉素?fù)p傷后的血管內(nèi)皮細(xì)胞NO 升高，ROS 減少。見表2和圖7。

表2 各組藥物處理48 h 后NO 及ROS 水平比較 （±s）

表2 各組藥物處理48 h 后NO 及ROS 水平比較 （±s）

注： ①與正常組比較，P ＜0.05；②與阿霉素組比較，P ＜0.05。

組別 NO ROS正常組 1.000±0.000 1.000±0.000阿霉素組 0.282±0.046① 2.730±0.294①阿霉素+Rg1 組 1.752±0.207①② 1.752±0.238①②F 值 108.088 47.445 P 值 0.000 0.000

2.5 人參皂苷Rg1 對阿霉素?fù)p傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞Bcl-2、p-ERK、p-Akt 及p-eNOS 蛋白相對表達(dá)量的影響

藥物作用48 h 后，各組Bcl-2、p-ERK、p-Akt及p-eNOS 蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。阿霉素組較正常組低（P＜0.05），阿霉素+Rg1 組較阿霉素組高（P＜0.05）。見表3和圖8。

圖7 人參皂苷RG1 對阿霉素所致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后ROS 及NO 水平的影響 （×200）

表3 各組Bcl-2、p-ERK、p-Akt 及p-eNOS 蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

表3 各組Bcl-2、p-ERK、p-Akt 及p-eNOS 蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

注： ①與正常組比較，P ＜0.05；②與阿霉素組比較，P ＜0.05。

組別 Bcl-2 p-ERK p-Akt p-eNOS正常組 0.605±0.025 1.750±0.228 1.056±0.121 0.870±0.054阿霉素組 0.261±0.015① 0.522±0.062① 0.418±0.085① 0.187±0.021①阿霉素+Rg1 組 0.390±0.015② 0.858±0.115② 0.794±0.057② 0.866±0.054②F 值 263.263 70.621 37.745 222.906 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖8 人參皂苷Rg1 對阿霉素?fù)p傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)蛋白的影響

3 討論

阿霉素對心臟的毒性作用表現(xiàn)為急性和慢性損害，導(dǎo)致左心功能下降、擴(kuò)張型心肌病和心力衰竭。心肌細(xì)胞的ROS 及凋亡是阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的主要特征[3-4]。多種藥物可預(yù)防阿霉素引起的心臟毒性，如抗氧化劑、金屬螯合劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶和β 受體阻滯劑，并取得了一定程度的成功[4、10-12]。有學(xué)者報道，藥用植物能預(yù)防阿霉素引起的心臟毒性[13-15]。從植物中尋找防止阿霉素心臟毒性的天然化合物，對降低阿霉素對化療患者心臟毒性具有重要的臨床意義。

人參是一種著名的傳統(tǒng)中藥，因具有強(qiáng)身健體及滋補(bǔ)作用而被人們廣泛使用。人參的主要活性成分是人參皂苷，包括Rg1、Rg3、Rh1、Re 和Rd。一些研究表明，Rg1 能防止心臟缺血再灌注損傷，縮小心臟的梗死面積，防止心臟病理性重塑[16-18]。最近研究發(fā)現(xiàn)Rg1 可以防止阿霉素引起的心臟毒性。其通過促進(jìn)Akt 和ERK 的磷酸化，增加Bcl-2 和Bax 的比例，減少細(xì)胞色素C 從線粒體釋放入胞漿，從而抑制阿霉素引起的心臟細(xì)胞凋亡[8]。

既往研究主要注重阿霉素對心肌細(xì)胞的損傷，而對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的研究較為少見。因為血管內(nèi)皮細(xì)胞在心臟病理、生理過程中起重要作用，而阿霉素對血管內(nèi)皮細(xì)胞也具有毒性作用，所以減輕阿霉素引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷對保護(hù)心臟具有重要意義。R?S?NEN 等[5]報道，VEGF-B基因可以通過保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制阿霉素引起的心臟毒性。而有學(xué)者報道Rg1 對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用[6-7]。提示Rg1可以通過保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞防止阿霉素引起的心臟損傷。本研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1 可防止阿霉素引起的心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，包括促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及小管形成，減少ROS 及阿霉素引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

ROS 在細(xì)胞凋亡中起重要作用。BUCCELLATO等[19]發(fā)現(xiàn)，鼠原始細(xì)胞上皮細(xì)胞暴露于高氧狀態(tài)導(dǎo)致ROS 產(chǎn)生，同時導(dǎo)致線粒體膜上BAX 的激活、細(xì)胞色素C 的釋放和細(xì)胞凋亡。BAI 等[20]發(fā)現(xiàn)，芝麻素通過激活A(yù)kt 和ERK，防止因ROS 產(chǎn)生的結(jié)腸炎。NO作為一種信號分子，在細(xì)胞的生理和病理過程中起重要作用；eNOS 作為NO 誘導(dǎo)合成的限速酶，在抑制細(xì)胞凋亡中起重要作用[21]。MU 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素抑制eNOS 表達(dá)，引起ROS 增多，而熊果酸通過升高eNOS，抑制ROS，保護(hù)阿霉素引起的心臟損傷?；罨疉kt/eNOS，減少ROS，減少炎癥引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[23]；而ERK 通路活化在堿性成纖維細(xì)胞生長因子保護(hù)腦微血管細(xì)胞中起重要作用[24]。本研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1 提高Bcl-2、p-Akt、p-ERK 及p-eNOS 的相對表達(dá)量，提示人參皂苷Rg1 可能通過增加Bcl-2、p-Akt、p-ERK 及p-eNOS 表達(dá)從而減輕阿霉素對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

綜上所述，人參皂苷Rg1 可減輕阿霉素引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，可能的機(jī)制為通過增加Bcl-2、p-Akt、p-ERK 及p-eNOS 表達(dá)從而減輕阿霉素對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。