脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義

翁壽向，楊佩濃

（浙江省臺(tái)州醫(yī)院 病理科，浙江 臨海 317000）

結(jié)直腸癌為最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率較高，近年來(lái)發(fā)病率呈遞增趨勢(shì)。大部分結(jié)直腸癌患者初診時(shí)已為中晚期，預(yù)后較差。結(jié)直腸癌的治療雖然已取得較大進(jìn)步，但是治愈率和生存率提高不明顯，仍存在轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高、缺乏有效的治療靶點(diǎn)等問(wèn)題。因此，尋找結(jié)直腸癌新的基因作為治療靶點(diǎn)具有重要意義。脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1（apurinic/apyrimidinic endonuclease 1, APE1）被證實(shí)在多種惡性腫瘤中表達(dá)[1]，為脫嘌呤/嘧啶內(nèi)切酶的主要活性成分，其高表達(dá)和多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后關(guān)系密切[2-3]。本文對(duì)結(jié)直腸癌組織中APE1 表達(dá)及其與臨床病理特點(diǎn)和預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行研究，探討其在結(jié)直腸癌中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年10月—2017年9月浙江省臺(tái)州醫(yī)院收治的100 例結(jié)直腸癌患者的結(jié)直腸癌組織及其癌旁組織（距離腫瘤切緣≥5 cm）標(biāo)本，組織標(biāo)本采集后立即放入液氮中保存。其中，男性56 例，女性44 例；年齡（62.75±8.43）歲；結(jié)腸癌46 例，直腸癌54 例；腫瘤直徑（4.72±2.37）cm；腫瘤分期： Ⅰ期37 例，Ⅱ期26 例，Ⅲ期28 例，Ⅳ期9 例；分化程度： 低分化35例，中分化38例，高分化27例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移18 例。納入標(biāo)準(zhǔn)： ①臨床資料完整；②病理證實(shí)為結(jié)直腸癌；③足夠樣本量行免疫組織化學(xué)染色；④接受隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)： ①結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)；②其他部位惡性腫瘤；③既往接受放化療等其他治療。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器鼠抗人APE1 單克隆抗體、二抗及DAB 顯色劑均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，艾博抗購(gòu)自上海貿(mào)易有限公司，廣東美的公司W(wǎng)K2102 電磁爐，APE1 購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。

1.2.2 HE 染色測(cè)定結(jié)直腸癌和癌旁組織中APE1 蛋白表達(dá)將結(jié)直腸癌和癌旁組織石蠟切片經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)，采用過(guò)氧化氫去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，封閉液封閉30 min，加入鼠抗人APE1 單克隆抗體（1 ∶300）過(guò)夜孵育；加入山羊抗小鼠二抗（1 ∶1 000）孵育1 h，加入DAB 顯色液顯色，顯微鏡下拍照觀察。結(jié)果判斷： APE1 陽(yáng)性產(chǎn)物主要位于細(xì)胞核，根據(jù)細(xì)胞染色程度和陽(yáng)性細(xì)胞染色率判斷陽(yáng)性細(xì)胞。染色程度： 不著色計(jì)0 分；淡棕黃色計(jì)1 分；深棕褐色計(jì)3分；淡棕黃色和深棕褐色之間計(jì)2 分。細(xì)胞染色率： 染色率≤5%為0 分，染色率＞5%～25%為1 分；染色率＞25%～50%為2 分；染色率＞50%～75%為3 分；染色率＞75%為4 分。細(xì)胞染色程度和染色率相乘得到總分： 0 ～3 分為低表達(dá)； 4 ～12 分為高表達(dá)[4]。

1.3 隨訪

隨訪時(shí)間從病理確診開始至患者死亡或隨訪截止時(shí)間。隨訪截止時(shí)間為2019年9月30日，隨訪方式為門診隨訪或電話隨訪。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)，Kaplan-Meie 法繪制生存曲線，預(yù)后影響因素用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APE1 在結(jié)直腸癌和癌旁組織中的表達(dá)

細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性細(xì)胞。APE1 在癌旁組織中低表達(dá)，在癌組織中高表達(dá)。見圖1。

APE1 在結(jié)直腸癌和癌旁組織中的表達(dá)率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=42.388，P=0.000），APE1 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)率高于癌旁組織（71.00% VS 25.00%）。

圖1 APE1 在結(jié)直腸癌和癌旁組織中的表達(dá)（HE 染色×400）

2.2 APE1 表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

APE1 在不同腫瘤大小、腫瘤分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的表達(dá)比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），腫瘤直徑≥5 cm、腫瘤分期Ⅲ和Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織中APE1 陽(yáng)性表達(dá)率高于腫瘤直徑＜5 cm、腫瘤分期Ⅰ和Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者。APE1在不同年齡、性別、腫瘤位置及分化程度的表達(dá)比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 APE1 表達(dá)與生存率的關(guān)系

所有患者中位隨訪時(shí)間為45.35 個(gè)月（5 ～60 個(gè)月），共41 例患者死亡。APE1 高表達(dá)組與低表達(dá)組總生存率分別為57.14%和82.76%，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.238，P=0.013），APE1 高表達(dá)組低于APE1 低表達(dá)組。見圖2。

2.4 APE1 對(duì)結(jié)直腸癌預(yù)后的影響

以總生存期為因變量，以單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的腫瘤大小、腫瘤分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為自變量，進(jìn)行一般多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)分析，結(jié)果顯示APE1 表達(dá)、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為結(jié)直腸癌總生存期的獨(dú)立影響因素（P＜0.05）。見表3。

表1 不同因素的結(jié)直腸癌組織中APE1陽(yáng)性率比較 （n =100）

圖2 不同APE1 表達(dá)結(jié)直腸癌患者總生存率曲線

表3 多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)分析結(jié)直腸癌總生存期影響因素的參數(shù)

3 討論

APE1基因定位在14 號(hào)染色體上，分為N 端和C端2 個(gè)功能區(qū)。不同功能區(qū)執(zhí)行不同功能： N 端功能區(qū)主要調(diào)控氧化還原功能；C 端功能區(qū)主要發(fā)揮核酸內(nèi)切酶的功能，其可以促進(jìn)DNA 修復(fù)的進(jìn)程[5-6]。惡性腫瘤為一種多基因突變引起的疾病，當(dāng)DNA 修復(fù)相關(guān)的基因發(fā)生突變時(shí)，可引起修復(fù)相關(guān)蛋白功能障礙或者異常表達(dá)，導(dǎo)致DNA 鏈不能馬上修復(fù)， DNA損傷積累到一定程度時(shí)即可導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生[7-9]。大量DNA 修復(fù)基因與惡性腫瘤的發(fā)病關(guān)系密切。APE1 為DNA 的修復(fù)途徑—堿基切除修復(fù)途徑中的主要限速酶，APE1 表達(dá)異常必然會(huì)影響DNA 修復(fù)，從而導(dǎo)致惡性腫瘤等疾病的發(fā)生[10-11]。多種惡性腫瘤中APE1 表達(dá)異常，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。SUN 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，APE1 在肝細(xì)胞癌中表達(dá)升高，可影響肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡。YANG 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，APE1 在非小細(xì)胞肺癌中可影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。YUAN 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，APE1 過(guò)表達(dá)與惡性腫瘤的不良預(yù)后關(guān)系密切。

APE1基因與結(jié)直腸癌的關(guān)系也受到大家關(guān)注。WANG 等[15]發(fā)現(xiàn)，血清APE1-Aabs 在大腸癌的診斷中具有一定臨床價(jià)值。吉祖進(jìn)等[16]發(fā)現(xiàn)，APE1 可影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。BALLISTA-HERNáNDEZ等[17]發(fā)現(xiàn)，APE1 在致癌物誘導(dǎo)的大腸癌中具有保持線粒體DNA 完整性的作用。LAI 等[18]發(fā)現(xiàn)，臺(tái)灣地區(qū)APE1多態(tài)性與大腸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系密切。本文對(duì)APE1 蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中APE1 陽(yáng)性表達(dá)率升高，表明APE1 參與結(jié)直腸癌的發(fā)病過(guò)程。APE1 陽(yáng)性率與結(jié)直腸癌患者的腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，表明APE1 與結(jié)直腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。結(jié)合上述既往研究及本研究結(jié)果，分析APE1 作為堿基切除修復(fù)途徑的主要限速酶，其表達(dá)升高可影響結(jié)直腸癌細(xì)胞DNA 修復(fù)，從而導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。APE1 可能通過(guò)影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，從而影響結(jié)直腸癌的惡性程度。APE1 高表達(dá)組總生存率降低，APE1 為結(jié)直腸癌患者生存期的獨(dú)立影響因素，表明APE1 為結(jié)直腸癌預(yù)后評(píng)估指標(biāo)，結(jié)直腸癌組織中APE1 高則預(yù)后差。分析結(jié)直腸癌患者APE1 陽(yáng)性率與結(jié)直腸癌的腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等侵襲轉(zhuǎn)移惡性關(guān)系密切，其陽(yáng)性率越高，結(jié)直腸癌惡性程度越高，故患者預(yù)后越差，生存率越低。關(guān)于APE1在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機(jī)制，尚需行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞研究進(jìn)一步探討。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中APE1 高表達(dá)，APE1表達(dá)與結(jié)直腸癌的惡性程度有關(guān)，APE1 有望成為結(jié)直腸癌的治療靶標(biāo)和預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。