基于化學(xué)計量學(xué)黃花白及和小白及HPLC指紋圖譜分析

秦亞東，汪榮斌，方鳳滿，張立菊，李林華

基于化學(xué)計量學(xué)黃花白及和小白及HPLC指紋圖譜分析

秦亞東1,2，汪榮斌1,2，*方鳳滿2，張立菊3，李林華1

(1．安徽中醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)系，安徽，蕪湖 241000；2．安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽，蕪湖 241000；3．魯南制藥股份有限公司質(zhì)管部，山東，臨沂 276000)

采用高效液相色譜（HPLC）法建立6批黃花白及和8批小白及指紋圖譜并比較Militarine含量，利用相似度（SA）、聚類分析（HCA）和主成分分析（PCA）對黃花白及和小白及進行綜合評價。結(jié)果顯示HPLC指紋圖譜共生成26個共有峰，利用對照品指認12號色譜峰為Militarine，且其含量在二者之間具顯著性差異（﹤0.01）；SA分析顯示黃花白及和小白及相似度大于0.912，具較高的相似性；HCA和PCA將黃花白及和小白及分為兩類，表明兩者存在一定的差異性，分析結(jié)果相互驗證。結(jié)果表明黃花白及和小白及化學(xué)組成類似，HPLC指紋圖譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法適用于兩者的區(qū)分和內(nèi)在質(zhì)量評價。

黃花白及；小白及；指紋圖譜；化學(xué)計量學(xué)；質(zhì)量評價

黃花白及Schltr.（BOS）和小白及(Hayata) Schltr.（BFS）為在我國分布的4種白及屬植物中的2種，具有較高的觀賞價值和藥用價值，廣泛分布于云南、貴州、四川等地。白及屬藥用植物主要含有聯(lián)芐類、菲類、黃酮類及2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類等化學(xué)成分[1-2]，現(xiàn)代研究表明這些化學(xué)成分在抗菌[3-5]、抗腫瘤[6]、抗炎[7]等方面均體現(xiàn)出活性。

近些年來，隨著市場需求量的增加，白及野生資源嚴(yán)重退化，已不能滿足市場需求。由于BOS和BFS外觀與白及十分相似，導(dǎo)致白及市場混摻現(xiàn)象時有發(fā)生。白及屬藥材以干燥塊莖入藥，BOS和BFS具止血補肺、消腫生肌之功效[1],與《中國藥典》2015版一部所載白及屬正品白及(Thumb.) Rchbf.收斂止血、消腫生肌[8]的功效表述有異，BOS和BFS常作為習(xí)用藥材及民族傳統(tǒng)藥材廣泛使用[9-10]。相對于白及，BOS和BFS在整體品質(zhì)評價方面研究較為鮮見，陳美君等[10]對BOS和BFS指紋圖譜進行了研究，但僅測定了3批BFS樣本；吳梅等[11]進行了BFS指紋圖譜研究，但未與BOS進行對比研究。為從整體角度評價BOS和BFS內(nèi)在質(zhì)量的異同，本研究利用高效液相指紋圖譜（HPLC）建立BFS和BFS指紋圖譜，以共有峰峰面積為變量，采用相似度評價（Similarity Analysis, SA）、聚類分析（Hierarchical Clustering Analysis, HCA）和主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）進行多元統(tǒng)計分析[12-13]，明確BOS和BFS在化學(xué)成分方面整體內(nèi)在質(zhì)量異同，以期為BOS和BFS內(nèi)在質(zhì)量評價提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

超高效液相色譜色譜儀（美國Agilent公司，1290型）、電子天平（美國Ohaus公司，Discovery DV215CD型）、超聲波清洗儀（合肥金尼克機械制造有限公司，JK-250DB型）、臺式離心機（德國Eppendorf公司，Minispin型）。

1.2 藥材

黃花白及和小白及于2017年采收于云南、貴州、四川，或購自與安徽亳州中藥材大市場樣品詳細信息見表1所示。根據(jù)《中國藥典》方法[8]要求，除去塊莖部分泥土及須根，煮沸15 min，曬至半干，除去外皮，曬干，粉碎后過40目篩，密封后置于4 ℃冰箱中保存。

表1 Militarine成分的含量（mg/g）及化學(xué)計量學(xué)統(tǒng)計結(jié)果

注：Species1，Schltr；Species2，Bletilla formosana (Hayata) Schltr

1.3 試劑

對照品Militarine（含量＞98%，批號：lot16122231）采購于上海遠慕生物科技有限公司；乙腈、甲酸為色譜級（美國TEADIA公司）、水為超純水（實驗室自制）；其他試劑為市售分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法和結(jié)果

2.1 樣品溶液的制備

精密稱取BOS、BFS粗粉0.2 g，精密稱定，置15 mL具塞離心管中，加入10 mL體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇-水溶液，加入冰袋，以控制超聲溫度不超過20 ℃，防止白及膠及黏液溶出而影響過濾，超聲1 h，離心（3000 r/min）5 min處理，提取液過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，備用。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱定Militarine對照品適量，置于10 mL容量瓶中，以體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇-水溶液為溶劑，定容至刻度，充分搖勻后為對照品溶液，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，備用。

2.3 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18column (50 mm×4.6 mm, 1.8 μm)，保護柱為Agilent SB-C18column (5 mm×2.1 mm, 1.8 μm)；流動相為：乙腈（A），0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫程序為：5% A（0 min），5%~20% A（0~10 min），20%~30% A（10~18 min），30%~30% A（18~23 min），30~33%A（23~30 min），33~60% A（30~45 min），60% A（45~50 min）；流速為0.3 mL·min-1，波長272 nm，柱溫30 ℃，進樣量5 μL，色譜圖如圖1所示。

圖1 對照品Militarine(a)、黃花白及和小白及(b)典型樣品HPLC圖譜

2.4 HPLC指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度考察

以BOS2為供試樣品，按“2.1”項下條件制備供試樣品溶液,以“2.3”項下參數(shù)設(shè)置要求為色譜條件，同一樣品（BOS2）重復(fù)進樣6次，以12號峰（Militarine）為參照，記錄并計算各共有峰相對峰面積（Relative Peak Area, RPA）及相對保留時間（Relative Retention Time, RRT）的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviations, RSD），結(jié)果RSD值均小于0.41%、0.73%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性考察

取BOS2為供試樣品，按“2.1”項下條件制備供試樣品溶液,以“2.3”項下參數(shù)設(shè)置要求為色譜條件，于0、2、4、8、12、24 h分別進樣，以12號峰（Militarine）為參照，記錄并計算各共有峰RPA和RRT的RSD，結(jié)果RSD值分別小于0.15%、0.34%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3重復(fù)性考察

取BOS2為供試樣品6份，按“2.1”項下條件制備供試樣品溶液,以“2.3”項下參數(shù)設(shè)置要求為色譜條件，以12號峰（Militarine）為參照，記錄并計算各共有峰RPA和RRT的RSD，結(jié)果RSD值分別小于0.78%、1.26%，表明重復(fù)性符合指紋圖譜要求。

2.5 HPLC指紋圖譜的建立

6批BOS樣品和8批BFS樣品，按“2.1”項下條件制備供試樣品溶液,以“2.3”項下參數(shù)設(shè)置要求為色譜條件進行測試，數(shù)據(jù)以AIA格式導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（中國藥典委員會，2004A版），以樣品BOS1為參照，時間窗寬度為0.1，采用中位數(shù)法，經(jīng)多點校正、自動匹配生成共有峰26個。測試樣品HPLC指紋圖譜疊加圖如圖2。

圖2 14批白及樣品的HPLC指紋圖譜

2.6 定量分析

參照相關(guān)文獻[14-15]，利用外標(biāo)一點法對主要成分（Militarine）進行定量，結(jié)果見表1所示。由表1直觀分析可見，Militarine在BOS樣品中的平均含量為26.02 mg/g，在BFS樣品中平均含量為17.28 mg/g，其在BOS 樣品中的平均含量是其在BFS樣品中的平均含量的1.51倍，差異顯著，具統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01)。

2.7 化學(xué)計量學(xué)分析

2.7.1 SA分析

將6批BOS樣品和8批BFS樣品HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)以AIA.格式導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件，以BOS1號樣品為參照圖譜，經(jīng)多點校正、自動匹配，生產(chǎn)對照指紋圖譜，結(jié)果見圖2所示，以對照指紋圖譜為參照，生成相似度，結(jié)果見表1。由表1可知，BOS樣品相似度在0.912~0.923之間，BFS樣品相似度在0.972~0.981之間，相似度均大于0.912，說明BOS樣品和BFS樣品的相似度較高，同時也存在一定差異。

2.7.2 HCA分析

采用無監(jiān)督的HCA分類模式，考察14批不同樣本之間的異同性。以6批BOS樣品和8批BFS樣品HPLC指紋圖譜26個共有峰峰面積為變量，變量歸一化處理后，形成14（樣品數(shù)）×26（變量數(shù)）的數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入Origin軟件，采用Educlidean距離進行HCA分析，結(jié)果見圖3。當(dāng)Educlidean距離大于2.6時，14批樣品分為兩大類，BFS樣品均聚集在Ⅰ大類，BOS樣品聚集在Ⅱ大類。HCA分析結(jié)果與SA分析結(jié)果相一致，SA結(jié)果顯示BFS和BOS樣品相似度十分接近，均大于0.89，但由HCA分析結(jié)果可以看出BFS和BOS樣品在HPLC指紋圖譜上仍體現(xiàn)出內(nèi)在差異。

圖3 14批樣品HPLC指紋圖譜聚類分析結(jié)果

2.7.3 PCA分析

為更加直觀的體現(xiàn)14批樣品內(nèi)在質(zhì)量差異性，將14批樣品HPLC指紋圖譜共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA-P（11.5版）軟件，變量經(jīng)歸一化處理后，進行PCA分析，結(jié)果見圖4。由圖4可見，所有BFS樣品分布在t[1]象限負值區(qū)域（Group 1），BOS樣品分布在t[1]象限正值區(qū)域（Group 2），BFS和BOS樣品完全分離，體現(xiàn)兩者之間的HPLC指紋圖譜的差異性；BFS樣品明顯的分為兩類，一類分布在t[1]象限負值和t[2]象限負值所組成的象限內(nèi)，包括BFS1、BFS2和BFS3，另一類分布在t[1]象限負值和t[2]象限正值所組成的象限內(nèi)，包括BFS4、BFS5、BFS6、BFS7和BFS8，與SA分析結(jié)果完全一致，說明BFS樣品間也存在一定的差異性。PCA結(jié)果與SA和HCA結(jié)果相一致，三者之間互相驗證。

圖4 14批樣品PCA得分圖

3 討論

隨著白及屬正品藥材白及野生資源的枯竭，以及白及育苗技術(shù)現(xiàn)實條件的制約，近年來白及價格持續(xù)攀高，白及藥材匱乏的現(xiàn)狀急需解決。然而關(guān)于白及屬藥用植物，黃花白及和小白及的研究較為鮮見。陳美君等對白及，黃花白及和小白及進行UPLC指紋圖譜研究表明，相似度均大于0.85，在化學(xué)成分層面，三者十分相似，并建議將黃花白及納入《中國藥典》[10]，但小白及只有3批，小白及樣本數(shù)偏少；吳梅等對白及和小白及進行HPLC指紋圖譜研究，結(jié)果表明二者的相似度大于0.751[11]，但白及樣品只有3批，同樣存在樣本數(shù)偏少的不足。

黃花白及和小白及兩種之間的HPLC指紋圖譜研究尚未見報道。由于黃花白及和小白及野生采樣困難，本研究僅對6批黃花白及和8批小白及，除3份來源于亳州中藥材大市場外，其余樣本均為野生采集。HPLC尤其適用于中藥復(fù)雜化學(xué)成分體系整體表征及定量分析[10-13,16]，結(jié)合多元統(tǒng)計分析能夠合理地反映不同來源樣本異同性[10-13]。本研究中指紋圖譜共匹配出26個共有峰，SA、HCA和PCA分析結(jié)果保持一致，可以互相驗證，說明黃花白及和小白及在化學(xué)組成方面高度相似，但仍存在一定的差異。黃花白及和小白及匹配出26個共有峰，多于白及與黃花白及、白及與小白及匹配出的共有峰數(shù)量[10-11]，也說明了黃花白及和小白及在化學(xué)組成層面較白及更為相似。由圖1-b可以直觀地看出，兩者化學(xué)組成類似，各成分含量比例不同；對于主要成分Militarine的含量，黃花白及顯著高于小白及，具有統(tǒng)計學(xué)意義。黃花白及和小白及在藥效學(xué)層面是否具有等效性，仍需深入研究證實。本研究通過黃花白及和小白及HPLC指紋圖譜研究表明，黃花白及和小白及在化學(xué)組成方面十分類似，相似度極高，為黃花白及和小白及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及合理開發(fā)使用提供理論依據(jù)。

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FINGERPRINT ANALYSIS OFANDBASED ON HPLC COMBINED WITH CHEMOMETRICS METHODS

QIN Ya-dong1, 2, WANG Rong-bin1, 2,*FANG Feng-man2, ZHANG Li-ju3, LI Lin-hua1

(1. Department of pharmacy, Anhui college of Traditional Chinese Medicine, Wuhu, Anhui 241002，China;2. College of life sciences, Anhui Normal University, Wuhu, Anhui 241002, China;3. Quality department, Lunan Pharmaceutical Group Corporation, Linyi, Shandong 276000, China)

High performance liquid chromatography (HPLC) fingerprints of 6 batches ofand 8 batches ofwere established and the content of Militarine was compared. The quality assessment was achieved by using similarity analysis (SA), hierarchical clustering analysis (HCA) and principal component analysis (PCA). The results indicatedthattwenty-six common characteristic peaks were found in all tested samples, peak 12 was identified as Militarine with significant differences in content (﹤0.01); Similarity values were all above 0.912, which indicated the tested samples has high similarity; All above results could validate each other and successfully group these samples into two categories, which showed the samples are different. The results showed that all tested samples have similar chemical composition, HPLC fingerprint technology combined with chemometrics methods could be used for differentiation and quality assessment on theandsamples.

;; fingerprint; chemometrics; quality assessment

R282

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2020.04.005

1674-8085(2020)04-0021-05

2019-10-27；

2020-03-06

安徽省高校重點科研項目（KJ2018A0789）；安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計劃項目（gxyq2017209）；安徽省高校學(xué)科（專業(yè)）拔尖人才學(xué)術(shù)資助重點項目（gxbjZD2016106）

秦亞東(1979-)，男，安徽宿州人，副教授，博士生，主要從事藥用植物生態(tài)學(xué)研究(E-mail: qydgy2007@163.com);

汪榮斌(1978-)，男，安徽蕪湖人，副教授，博士生，主要從事藥用植物資源研究(E-mail: 59858705@qq.com);

*方鳳滿(1974-)，女，安徽池州人，教授，博士，主要從事資源環(huán)境理論與實踐(E-mail:ffm1974@mail.ahnu.edu.cn);

張立菊(1979-)，女，山東臨沂人，助理工程師，主要從事藥物驗收工作(E-mail:924385258@qq.com);

李林華(1972-)，男，安徽蕪湖人，助理實驗師，主要從事中藥資源研究(E-mail: 1375816221@qq.com).