食管鱗癌根治術(shù)患者組織中CD8+/FOXP3+比值及PD-L1表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性

張成偉，唱 寬，毛志剛，舒 建

(中國(guó)人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院心胸外科，遼寧 沈陽(yáng) 110042)

由于環(huán)境污染、飲食習(xí)慣改變等多種因素，食管癌患病率攀升到惡性腫瘤第8位，不同的人種、地區(qū)食管癌類型有一定差別，在我國(guó)絕大部分患者為食管鱗癌(Esophageal squamous carcinoma，ESCC)[1,2]。與大多數(shù)惡性腫瘤相同，早期ESCC無(wú)明顯臨床癥狀，晚期患者5年生存率僅10%，臨床治療以手術(shù)為主，因此需要可預(yù)防ESCC轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的治療策略，進(jìn)一步提高患者預(yù)后生存情況[3,4]。隨著人們對(duì)免疫系統(tǒng)的深入研究，發(fā)現(xiàn)了程序性死亡分子配體1(Programmed death ligand 1，PD-L1)與其受體(PD-1)組成的信號(hào)通路對(duì)免疫細(xì)胞有調(diào)控作用[5]。本研究檢測(cè)了免疫細(xì)胞CD8+/FOXP3+比值和PD-L1在ESCC組織中的表達(dá)情況，結(jié)合患者預(yù)后情況進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料：將2014年1月至2019年1月我院行ESCC根治術(shù)患者的存檔蠟塊和癌旁正常組織(距病變部位>5cm處，且證實(shí)為無(wú)癌浸潤(rùn))石蠟標(biāo)本各110例作為研究對(duì)象。癌與癌旁組織取樣于男性92例，女性18例；年齡43～86歲，平均(73.64±6.09)歲。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn)：納入標(biāo)準(zhǔn)：①均行ESCC根治術(shù)；②無(wú)放化療治療史；③經(jīng)術(shù)后細(xì)胞學(xué)及組織學(xué)病理確診為ESCC，可以明確腫瘤大小、部位、浸潤(rùn)程度。排除標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)CT、MRI等影像學(xué)診斷無(wú)法確定TNM分期；②合并其他惡性腫瘤；③已診斷為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；④伴隨肺間質(zhì)疾病或嚴(yán)重肝腎功能障礙；⑤患有血液系統(tǒng)疾病或傳染病等。

1.3免疫組化：切取4μm厚石蠟組織切片，行常規(guī)HE復(fù)染確認(rèn)。經(jīng)烤片、脫蠟、水化后，進(jìn)行抗原熱修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、封閉非特異性結(jié)合后，滴加一抗室溫下孵育。TBST沖洗后滴加新鮮配制的DAB顯色，2～3min后用自來(lái)水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染，封固后于顯微鏡下觀察。已知的PD-L1、CD8+、FOXP3+陽(yáng)性標(biāo)本為陽(yáng)性對(duì)照。觀察高倍(×400)視野下陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及染色強(qiáng)度(見圖1)，陽(yáng)性細(xì)胞占比≤5%為0分、占比為6%～25%計(jì)1分、占比26%～50%計(jì)2分、占比51%～75%計(jì)3分、占比≥76%計(jì)4分；細(xì)胞未染色計(jì)0分、淡黃色為1分、棕黃為2分、棕褐為3分，總分=細(xì)胞染色評(píng)分×細(xì)胞占比評(píng)分，總分≥3分即為陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)果評(píng)判由2人進(jìn)行雙盲讀片確定。

圖1 ①ESCC組織中PD-L1陽(yáng)性表達(dá)；②ESCC組織中FOXP3+陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞核染色；③ESCC組織中CD8+陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞膜染色

1.4觀察指標(biāo)：①比較CD8+/FOXP3+、PD-L1在ESCC組織和癌旁正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)；②收集110例ESCC患者臨床資料，分析年齡、性別、腫瘤部位、TNM分期、浸潤(rùn)、分化程度與CD8+/FOXP3+、PD-L1陽(yáng)性表達(dá)的關(guān)系；③對(duì)110例ESCC根治術(shù)患者通過(guò)電話或門診的形式隨訪，末次隨訪時(shí)間為2020年1月，統(tǒng)計(jì)患者生存情況，分析CD8+/FOXP3+、PD-L1表達(dá)與1年生存率的關(guān)系，無(wú)失訪患者。

2 結(jié) 果

2.1CD8+/FOXP3+比值、PD-L1在ESCC組織和癌旁正常組織中的表達(dá)：CD8+/FOXP3+在ESCC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁組織，PD-L1在ESCC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織(P<0.05)，見表1。

表1 ECD8+/FOXP3+ PD-L1在ESCC組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

2.2CD8+/FOXP3+比值、PD-L1與ESCC臨床病理參數(shù)間的關(guān)系：不同TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、浸潤(rùn)程度、腫瘤直徑和分化程度的ESCC組織中CD8+/FOXP3+、PD-L1的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但不同年齡、性別的ESCC組織中CD8+/FOXP3+比值、PD-L1 CD8+/FOXP3+表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 CD8+/FOXP3+比值 PD-L1與ESCC臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

2.3影響ESCC患者預(yù)后生存的單因素分析：110例行ESCC根治術(shù)患者1年總生存率為86.36%(95/110)，單因素分析顯示，TNM分期T1～2期的患者1年生存率為高于T3期患者；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者1年生存率低于未合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者；PD-L1陽(yáng)性表達(dá)組患者1年生存率低于陰性表達(dá)組患者；CD8+/FOXP3+陽(yáng)性表達(dá)組患者1年生存率高于陰性表達(dá)組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，不同年齡、性別、浸潤(rùn)程度、腫瘤直徑的ESCC根治術(shù)患者生存率比較無(wú)差異(P>0.05)，見表3。

表3 影響ESCC患者預(yù)后生存的單因素分析

2.4影響ESCC患者預(yù)后生存的多因素分析：以ESCC患者術(shù)后1年生存情況為因變量，以上述有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義項(xiàng)(TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PD-L1、CD8+/FOXP3+)作為自變量，對(duì)上述因素進(jìn)行賦值，(TNM分期：T1～2期=1、T3期=0；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：無(wú)=1、有=0；PD-L1：陰性=1、陽(yáng)性=0；CD8+/FOXP3+：陽(yáng)性=1、陰性=0)，并將其納入Logisitic回歸模型中，發(fā)現(xiàn)TNM T3期分期、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PD-L1陽(yáng)性表達(dá)、CD8+/FOXP3+陰性表達(dá)是ESCC患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P<0.05)，見表4。

表4 影響ESCC患者預(yù)后生存的多因素分析

3 討 論

近年來(lái)環(huán)境污染加劇，人們飲食習(xí)慣改變，食管癌患病率逐年攀升，在我國(guó)絕大部分患者表現(xiàn)為ESCC，早期ESCC無(wú)明顯臨床癥狀，晚期患者5年生存率僅10%。ESCC的發(fā)病率逐年升高，根治性手術(shù)和術(shù)后輔助化療是目前的主要治療手段，ESCC因部位特殊性、腫瘤大小、分化程度等指標(biāo)會(huì)影響根治性手術(shù)切除的效果和預(yù)后情況[6]。目前對(duì)行ESCC根治術(shù)患者預(yù)后的預(yù)測(cè)主要通過(guò)檢測(cè)血清腫瘤標(biāo)志物水平和明確TNM分期，但二者對(duì)ESCC患者預(yù)后的判斷準(zhǔn)確度較低[7]。因此，繼續(xù)尋找新的生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)提高患者的術(shù)后治療效果顯得尤為必要。

PD-1/PD-L1通路在惡性腫瘤的發(fā)展中有負(fù)向調(diào)節(jié)作用，PD-L1作為一種跨膜蛋白，對(duì)免疫細(xì)胞有一定活化作用，可以幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)淋巴細(xì)胞的進(jìn)攻，關(guān)嵩[8]等研究指出經(jīng)免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PD-L1在ESCC患者組織中的陽(yáng)性表達(dá)率與性別、腫瘤分期、分化程度相關(guān)。又有研究指出PD-L1在ESCC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率遠(yuǎn)高于正常組織[9]。CD8+對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力在多項(xiàng)研究中被證實(shí)，通過(guò)分泌穿孔素和淋巴毒素等多種方式殺死腫瘤細(xì)胞；而FOXP3+基因突變會(huì)引發(fā)自身免疫缺陷疾病，阻礙淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能；所以CD8+/FOXP3+比值的表達(dá)情況與自身免疫系統(tǒng)的功能相關(guān)，CD8+/FOXP3+表達(dá)越高，免疫系統(tǒng)在抗腫瘤過(guò)程中發(fā)揮的效用越高[10]。高翔[11]等的研究提示術(shù)前血清中性粒淋巴細(xì)胞比值與患者預(yù)后密切相關(guān)。本研究中，ESCC的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和浸潤(rùn)程度影響CD8+/FOXP3+和PD-L1的表達(dá)情況，腫瘤的直徑、分化程度影響PD-L1表達(dá)，說(shuō)明PD-L1和CD8+/FOXP3+的表達(dá)與多項(xiàng)臨床病理參數(shù)都有關(guān)系，可能對(duì)患者的預(yù)后有影響。

本研究對(duì)比了患者預(yù)后生存情況，110例行ESCC根治術(shù)患者1年總生存率為86.36%(95/110)，單因素分析顯示PD-L1陽(yáng)性表達(dá)患者1年生存率低于陰性表達(dá)患者；CD8+/FOXP3+陽(yáng)性表達(dá)患者1年生存率高于陰性表達(dá)患者，提示PD-L1陰性表達(dá)與CD8+/FOXP3+陽(yáng)性表達(dá)對(duì)患者預(yù)后有正向影響，這與PD-L1激活后幫助腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)展、FOXP3+陰性表達(dá)影響免疫系統(tǒng)的正常運(yùn)作、CD8+陽(yáng)性表達(dá)利于溶解腫瘤細(xì)胞的功能相關(guān)。多因素分析結(jié)果顯示，TNM T3期分期、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PD-L1陽(yáng)性表達(dá)、CD8+/FOXP3+陰性表達(dá)是影響ESCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示CD8+/FOXP3+陽(yáng)性表達(dá)、PD-L1陰性表達(dá)、TNM分期為T3期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的行ESCC根治術(shù)的患者可能出現(xiàn)不良預(yù)后，應(yīng)在臨床治療中重點(diǎn)觀察。本研究亦存在不足之處，回顧性研究選例存在偏倚，有待日后擴(kuò)大樣本進(jìn)行前瞻性研究，驗(yàn)證CD8+/FOXP3+、PD-L1在ESCC患者體內(nèi)的表達(dá)與其預(yù)后生存的關(guān)系。

綜上所述，CD8+/FOXP3+陽(yáng)性表達(dá)、PD-L1陰性表達(dá)、TNM分期為T3期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響ESCC根治術(shù)后患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可以為今后免疫治療藥物、患者術(shù)后治療提供一定參考。