牛冷凍精液保存時(shí)間對精液品質(zhì)及其受精能力的影響

崔艷穎，史秀杰，張美佳，楊 健，武占營，郝肖瓊,*

（1.包頭醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古包頭 014040；2.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳 518026；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

精液冷凍保存技術(shù)對豬和牛等優(yōu)良家畜的快速繁殖以及瀕危動(dòng)物的拯救具有重大實(shí)踐意義，準(zhǔn)確而客觀地評價(jià)精子受精能力可使優(yōu)良精子資源得到充分利用。精液質(zhì)量的評價(jià)指標(biāo)主要包括精子的直線運(yùn)動(dòng)狀態(tài)、活率、質(zhì)膜完整性、頂體完整率等[1]，精子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)可利用計(jì)算機(jī)輔助精子分析儀 （CASA） 來分析[2]，該方法準(zhǔn)確客觀，但有些精子雖具有良好的運(yùn)動(dòng)能力，卻無受精能力[3]。研究認(rèn)為，精液冷凍-凍融過程中精子質(zhì)膜最易受損，同時(shí)精子DNA 也會受到影響[4]，這些都會導(dǎo)致精子的受精能力下降[5]，因此，精子DNA 損傷程度也是評價(jià)精液品質(zhì)的一個(gè)指標(biāo)[6-7]。精子線粒體是維持精子活力的關(guān)鍵細(xì)胞器[8-10]，精子直線運(yùn)動(dòng)能力和線粒體活性密切相關(guān)；線粒體膜通道孔的開放能夠顯著改變線粒體的通透性[11]，也是評價(jià)精液品質(zhì)的依據(jù)。此外，線粒體耗氧量也是檢測精子線粒體功能的一個(gè)指標(biāo)[12-13]。

冷凍精液不同保存時(shí)間會導(dǎo)致精子受精能力不同，本實(shí)驗(yàn)旨在檢測不同保存時(shí)間的牛凍精的精子活力、DNA 完整性和線粒體功能等并分析功能指標(biāo)與受精能力的相關(guān)性，為建立既快速又能準(zhǔn)確反映牛凍精受精能力的方法、評價(jià)牛冷凍精液受精能力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 冷凍精液來源 3 批荷斯坦奶牛冷凍精液分別為A 凍精（2018 年冷凍，保存1 年）、B 凍精（2016 年冷凍，保存3 年）和C 凍精（2006 年冷凍，保存13 年），均來自于北京奶牛中心。每批鮮精都來自4 頭種公牛，采用相同的冷凍方法冷凍，液氮保存。精液在冷凍前后均進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測，3 批精液精子活力、活率、直線運(yùn)動(dòng)狀態(tài)、頂體染色率等指標(biāo)在鮮精或者凍精間沒有差異。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 實(shí)驗(yàn)所用試劑均購自Sigma 公司，培養(yǎng)液購自Gibco 公司，通用型DNA 損傷彗星檢測試劑盒、MTT 比色法細(xì)胞繁殖定量檢測試劑盒、活體細(xì)胞線粒體膜通道孔（MPTP）熒光檢測試劑盒、活體細(xì)胞線粒體內(nèi)膜功能（膜電位）熒光測定試劑盒、精子活力和頂體反應(yīng)三色染色試劑盒、呼吸鏈依賴性純化線粒體氧化應(yīng)激活性氧熒光測定試劑盒購自上海杰美基因。正置光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本）；熒光顯微鏡（Leica，德國）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific，美國）；偉力精子分析儀WLJY-9000（北京偉力新世紀(jì)科技發(fā)展有限公司，中國）；電熱恒溫水浴箱（精宏 KD-S24，中國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 精子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)檢測 利用偉力精子分析儀檢測3批牛冷凍精液的精子活力、運(yùn)動(dòng)前向行、直線運(yùn)動(dòng)速度、曲線運(yùn)動(dòng)速度、直線性、擺動(dòng)性、和鞭打頻率。

1.2.2 精子頂體完整率測定 按照精子活力和頂體反應(yīng)三色染色試劑盒說明書操作，光學(xué)顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)（每個(gè)視野計(jì)數(shù)200 個(gè)精子）。其中，著粉紅色為頂體完整精子，頂體未著色為頂體不完整精子（頂體內(nèi)含物丟失，故未著色）。

1.2.3 精子活率檢測 精子胞膜具有選擇透過性，活精子的胞膜完整，臺盼藍(lán)拒染；而喪失活性或細(xì)胞膜不完整的精子細(xì)胞喪失選擇透過性，可被臺盼藍(lán)染成藍(lán)色。利用臺盼藍(lán)染色后統(tǒng)計(jì)拒染精子所占精子的百分比，光學(xué)顯微鏡觀察精子染色情況。

1.2.4 線粒體功能檢測 按照活體細(xì)胞線粒體膜通道孔熒光檢測試劑盒說明書操作檢測精子細(xì)胞線粒體膜通道孔（MPTP），線粒體膜通道孔相對熒光單位（RFU）值降低，表明膜通道孔活性增強(qiáng)。利用MTT 比色法細(xì)胞繁殖定量檢測試劑盒檢測精子線粒體活性，吸光值與細(xì)胞量呈線性正相關(guān)，能夠反映線粒體活性。利用活體細(xì)胞線粒體內(nèi)膜功能（膜電位）熒光測定試劑盒檢測精子線粒體膜電位（MMP）。利用呼吸鏈依賴性純化線粒體氧化應(yīng)激活性氧熒光測定試劑盒檢測線粒體氧化應(yīng)激活性氧（ROS）。

1.2.5 精子DNA 完整性檢測 利用通用型DNA 損傷彗星檢測試劑盒檢測精子DNA 完整性，DNA 損傷后其DNA 碎片拖尾，形成典型的“彗星”圖像，根據(jù)遷移長度和熒光強(qiáng)度即可定量分析DNA 損傷的程度。在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.6 牛冷凍精液的受精能力檢測 牛卵母細(xì)胞培養(yǎng)：牛卵巢采自河北省屠宰場，保存于28～30℃生理鹽水，2 h 內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，用含有青、鏈霉素的37℃生理鹽水洗滌卵巢3 次，采用真空泵和18 號針頭抽取直徑為2～6 mm 卵泡中的卵泡液，顯微鏡下挑選包含3 層及3 層以上卵丘細(xì)胞且胞質(zhì)均勻的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs），放入四孔板（每孔50 枚），置于38.5℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22～24 h；體外成熟培養(yǎng)液包含TCM-199、0.01 IU/mL 促卵泡素（FSH）、10 IU/mL 促黃體生成素（LH）、1 μg/mL 雌二醇（E2）。體外受精（IVF）操作：成熟后的COCs 去除外周部分卵丘細(xì)胞，放于50 μL 的受精液滴中，每滴放入15～20枚 COCs，將精子和卵母細(xì)胞在38.5℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中共孵育8～16 h；受精液：112.0 mmol/L NaCl、4.02 mmol/L KCl、2.25 mmol/L CaCl2?2H2O、0.52 mmol/L MgCl2?6H2O、0.83 mmol/L KH2PO3、37.0 mmol/L NaHCO3、1.25 mmol/L 丙酮酸鈉、10 μg/mL Heparin、4 mg/mL BSA、10 mmol/L 咖啡因、雙抗（100 U/mL 青霉素+100 μg/mL 鏈霉素）。體外胚胎培養(yǎng)：利用玻璃針去除體外受精后8～16 h 受精卵外周卵丘細(xì)胞，將受精卵在前期胚胎培養(yǎng)液中洗3 遍，放入38.5℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后換入后期胚胎培養(yǎng)液，此后每隔48 h 進(jìn)行半量換液，并在2 d 和7 d 分別統(tǒng)計(jì)早期胚胎的卵裂率和囊胚率（囊胚率的統(tǒng)計(jì)以卵裂數(shù)為總數(shù)）。

1.2.7 基因表達(dá)分析 復(fù)蘇3 批冷凍精液之后，總RNA提取依照RNeasy micro-RNA isolation kit（Qiagen，美國）操作指南進(jìn)行，反轉(zhuǎn)依照QuantiTek（Qiagen，美國）反轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行，得到cDNA，Real-time PCR 方法檢測目的基因精子線粒體相關(guān)半胱氨酸富集蛋白（SMCP）、不溶性彈性蛋白3（TEKT3）、軸絲動(dòng)力蛋白1 （DNAH1）及T 復(fù)合體相關(guān)睪丸表達(dá)3（TCTE3）的相對表達(dá)量。相關(guān)引物序列見表1。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。用Sigma plot 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)類型采用方差分析（ANOVA）和t檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，P<0.05 為有顯著性差異。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 不同冷凍時(shí)間對牛精子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的影響 如表2 顯示，隨冷凍時(shí)間延長，精子活力和運(yùn)動(dòng)直線性均顯著下降。

2.2 不同冷凍時(shí)間對牛精子活率的影響 如圖1 所示，A 精液的精子活率（91%）顯著高于B（67%）、C 精液（59.67%）。

2.3 不同冷凍時(shí)間對牛精子頂體完整率的影響 如圖2 所示，A、B、C 3 批凍精的精子頂體完整率分別為98.13%、94.36%、88.28%，均高于國家標(biāo)準(zhǔn) （標(biāo)準(zhǔn)≥82%）。

2.4 牛冷凍解凍精液體外受精能力檢測 如圖3 所示，A、B 和C 3 批冷凍精液的卵裂率分別為70.77%、62.89%、51.90%；囊胚率分別為30.47%、25.14%、16.43%。說明隨冷凍保存時(shí)間延長，精液的受精能力顯著下降。

2.5 精子線粒體功能分析 如圖4 所示，線粒體膜通道孔的結(jié)果顯示，A 精液RFU 值最高，B 精液次之，C 精液RFU 值最低（P<0.05），表明A 精液線粒體的膜通道孔活性最高；線粒體膜電位結(jié)果顯示，A 精液最好；MTT 法間接測定精子線粒體活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A精液的光密度（Optical Density，OD）值最高（P<0.05），表明精液質(zhì)量最好；線粒體氧化應(yīng)激活性氧的測定顯示，A 精液ROS 最低（P<0.05）。

2.6 冷凍精液DNA 損傷檢測 如圖5 所示，A 精液拖尾最短（P<0.05），B 精液其次，C 精液拖尾最長（P<0.05），表明A 精液精子的DNA 碎片最少，DNA 損傷最輕，而C 精液精子的DNA 碎片最多，DNA 損傷程度最嚴(yán)重。

2.7 不同保存時(shí)間對弱精子癥相關(guān)蛋白基因表達(dá)水平的影響 如圖6 所示，4 種基因的表達(dá)趨勢未顯現(xiàn)出如IVF 實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致的趨勢，表達(dá)差異不顯著。

圖1 牛凍精解凍后精子臺盼藍(lán)染色

圖2 牛凍精解凍后精子頂體完整率

圖3 不同保存時(shí)間牛冷凍精液的IVF 后期胚胎發(fā)育情況

表2 不同冷凍時(shí)間對牛精子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的影響

圖4 不同保存時(shí)間牛冷凍精液精子線粒體功能分析

圖5 不同保存時(shí)間牛冷凍精液精子DNA 損傷測定

圖6 不同保存時(shí)間對牛冷凍精液弱精子癥相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討 論

精液冷凍保存技術(shù)對于大型哺乳動(dòng)物的人工繁育至關(guān)重要。本研究對不同冷凍時(shí)間的3 批荷斯坦奶牛精液進(jìn)行了檢測，由于冷凍時(shí)間跨度較長（1 年、3 年及13 年），沒有使用同一批冷凍的精液，但精液來源于同一品種公牛，3 批精液精子活力、活率、直線運(yùn)動(dòng)狀態(tài)、頂體染色率等指標(biāo)在鮮精或者凍精間沒有差異。本實(shí)驗(yàn)中，不同時(shí)期的?？赡苌杂杏绊?，但影響精子功能的主要是冷凍保存時(shí)間。

精子的活率、活力是影響精子受精能力的重要因素[6]。本研究中凍精的精子活力和活率在保存3 年后顯著下降，但繼續(xù)保存至13 年，下降不明顯，說明精子活率和活力主要在冷凍保存早期下降，短期冷凍對其影響較小，超過3 年后，精子活率及活力不再顯著下降。精子的直線運(yùn)動(dòng)狀態(tài)與母牛的受孕率關(guān)系密切。冷凍保存1年的精子直線運(yùn)動(dòng)性最高，保存3 年后，下降不明顯，而保存13 年后精子的直線運(yùn)動(dòng)性顯著下降，結(jié)果表明短時(shí)間的冷凍保存主要使精子的活力和活率下降，而長時(shí)間的冷凍主要使精子的直線運(yùn)動(dòng)性下降，導(dǎo)致受精能力下降。哺乳動(dòng)物頂體的頂體反應(yīng)是受精過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，冷凍精液中精子頂體的完整率是衡量精液品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)[14]。本研究表明，冷凍時(shí)間的延長對精子頂體完整率影響不明顯。

體外受精能力最能真實(shí)、客觀、準(zhǔn)確地反映精液品質(zhì)[6]。本研究結(jié)果表明，冷凍保存1 年的牛精液的卵裂率和囊胚發(fā)育率與以前報(bào)道的牛冷凍精液的受精率結(jié)果相似[15-16]，然而，冷凍保存3 年的精液受精率和囊胚發(fā)育率明顯下降，冷凍保存13 年的精液囊胚發(fā)育率進(jìn)一步下降，這表明冷凍精液保存1 年對受精率影響不大，但隨著冷凍保存的時(shí)間延長，精子的受精能力會顯著下降。

精子線粒體是精子運(yùn)動(dòng)的能量來源，因此線粒體功能狀態(tài)是影響精子受精能力的一個(gè)重要因素。線粒體活性、MMP 及MPTP 結(jié)果均表明，凍存將對牛精液精子線粒體功能造成嚴(yán)重?fù)p傷，這與之前關(guān)于綿羊精液精子線粒體的報(bào)道相一致[17]，且凍存時(shí)間越長，線粒體功能受損程度越嚴(yán)重，這可能是由于細(xì)胞凋亡或壞死時(shí)，線粒體內(nèi)容物通過膜通道孔釋放到胞漿中，膜通道孔開放，顯著增加了線粒體的通透性[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 批精液精子的DNA 均有碎片，表明牛精子冷凍會增加核DNA 碎片，這與冷凍對人類精子核DNA 造成損傷的研究結(jié)果相一致[18-19]；凍存1 年的精子的DNA 碎片較少，冷凍保存3 年后 DNA 碎片極顯著增加，冷凍保存13 年的精子DNA 碎片進(jìn)一步增加，這些結(jié)果表明精液冷凍導(dǎo)致線粒體膜通道孔通透性和DNA 損傷的變化幅度最大，可能是導(dǎo)致精子受精能力下降的內(nèi)在因素。

3 批牛冷凍精液精子中弱精子癥相關(guān)基因的表達(dá)并無明顯變化，可能是冷凍保存并不會導(dǎo)致遺傳異常，而弱精癥相關(guān)基因的表達(dá)主要受遺傳物質(zhì)影響，這與郭靚等[20]研究海福特公牛凍精保存35年并未發(fā)現(xiàn)遺傳異常相一致。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著冷凍時(shí)間的延長，精子的活力、直線性、活率、線粒體活性、MPTP、受精能力、DNA 完整性等指標(biāo)均下降，其中MPTP 和DNA 完整性指標(biāo)變化幅度最大，可作為判斷牛冷凍精液受精能力的參考指標(biāo)。