健脾化痰、解毒護(hù)肺方干預(yù)PM2.5顆粒致肺損傷大鼠的機(jī)制及形態(tài)學(xué)影響

孫熙桐,史鎖芳，2*,李玥，胡珀,張慧,朱匯濱,盛倩雯

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

近年來(lái)，全國(guó)各地頻現(xiàn)霧霾天氣，其主要致病源PM2.5顆粒具有強(qiáng)富集性，可攜帶有毒有害污染物遠(yuǎn)距離傳輸[1]，人體吸入后極易沉積于終末細(xì)支氣管及肺泡，嚴(yán)重干擾肺臟的氣體交換和血液循環(huán)，進(jìn)而誘發(fā)氣管、支氣管炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致多種呼吸系統(tǒng)疾病。研究表明，PM2.5顆?？赏ㄟ^(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和免疫異常等多種機(jī)制導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)損傷[2]。IFN-γ是由Th1細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子,主要介導(dǎo)與局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答。PM2.5顆粒暴露人群的血清中IFN-γ表達(dá)水平較正常人群顯著增高[3]。MDA是最常用的脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)之一。江蘇省中醫(yī)院呼吸科主任中醫(yī)師史鎖芳教授在運(yùn)用中醫(yī)理論治療PM2.5所致呼吸系統(tǒng)疾病方面有著豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)PM2.5的致病機(jī)制并結(jié)合多年臨證經(jīng)驗(yàn)，擬定“健脾化痰、解毒護(hù)肺方”應(yīng)用于臨床，療效顯著。本研究通過(guò)對(duì)此方干預(yù)PM2.5致肺損傷大鼠模型,探究中醫(yī)藥對(duì)PM2.5染毒大鼠肺組織損傷狀態(tài)及相關(guān)炎性因子表達(dá)水平的影響，并為中醫(yī)理論中“正氣存內(nèi)，邪不可干”的治療思路指導(dǎo)治療霧霾導(dǎo)致的呼吸系統(tǒng)疾病提供客觀依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康雄性大鼠25只，體質(zhì)量200～250 g[南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2014-0001]。購(gòu)買后在SPF級(jí)動(dòng)物房、維持溫度(15±2)℃、濕度(70±2)%環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。將大鼠隨機(jī)分為5組，分別為空白組、模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組和西藥組，每組各5只。

1.2 儀器設(shè)備與試劑

ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司提供)；Th-150系列智能中流PM2.5環(huán)境采樣器(武漢天虹儀表有限責(zé)任公司)；FDU-1200真空冷凍干燥機(jī)(杭州嘉維創(chuàng)新科技有限公司)；CQ-500B型超聲波清洗機(jī)(上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠)；LDZ5-2低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司)；γ-干擾素(IFN-γ)、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(海聯(lián)生物科技有限公司)。

1.3 藥物

健脾化痰、解毒護(hù)肺方(以下簡(jiǎn)稱霧霾方)組成：炒白術(shù)10 g,炙甘草5 g,薏苡仁20 g,桃仁5 g,蘆根20 g,冬瓜子15 g,陳皮6 g,瓜蔞皮10 g,皂角刺3 g,桑白皮10 g,苦杏仁10 g,黃芪12 g,桔梗5 g和法半夏10 g;購(gòu)于江蘇省中醫(yī)院中藥房，由實(shí)驗(yàn)人員煎取2倍人用劑量(1.41 g生藥/mL)濃煎劑。鹽酸氨溴索口服液(蘭蘇)，購(gòu)于江蘇省中醫(yī)院西藥房,臨用前由實(shí)驗(yàn)人員用雙蒸水配制成濃度為7.5%大鼠用劑。

2 方法

2.1 PM2.5的收集與混懸液配制

PM2.5懸液：采樣點(diǎn)設(shè)于南京市內(nèi)居民商業(yè)街區(qū)較高建筑物頂層(16層建筑，約50米高)，時(shí)間選擇在霧霾天氣易發(fā)生的下半年，具體時(shí)間為2017年8月—2019年1月，期間用Th-150系列智能中流PM2.5環(huán)境采樣器及聚丙烯濾膜連續(xù)采樣，濾膜經(jīng)超聲洗脫處理后，收集PM2.5溶液，真空冷凍干燥后-20 ℃保存。根據(jù)大鼠的一般生理特性，假設(shè)大鼠的潮氣量約為c=2.1 mL，呼吸頻率約為p=102次/min，暴露人群霧霾天氣下暴露時(shí)間t=8 h，對(duì)應(yīng)大鼠模型暴露時(shí)間一致。根據(jù)環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB3095-2012)，重度污染下空氣中PM2.5顆粒含量為m=250 μg/m3。則每只大鼠每日吸入PM2.5顆粒質(zhì)量計(jì)算公式為M=60 cptm/106(μg)≈26 μg，染毒前用生理鹽水配制成濃度為260 μg/mL的PM2.5混懸液。

2.2 動(dòng)物模型建立

模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組于模型建立當(dāng)日其經(jīng)鼻腔滴入配置好的PM2.5顆粒混懸液(0.1 mL/只)，1次/日，持續(xù)3周；空白組于模型建立當(dāng)日起經(jīng)鼻腔滴入0.9%氯化鈉溶液(0.1 mL/只)，1次/日，持續(xù)3周。實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)每日觀察大鼠染毒后的飲食情況、精神狀態(tài)及活動(dòng)的變化。造模期間每周及給藥結(jié)束后分別記錄體質(zhì)量，計(jì)算大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)百分率。

大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率(%)=(實(shí)時(shí)大鼠體質(zhì)量-染毒前大鼠體質(zhì)量)/染毒前大鼠體質(zhì)量×100%

2.3 給藥方法

按照參考文獻(xiàn)[4]的藥物劑量換算方法，空白組、模型組、中藥低劑量組及西藥組給藥量為10 mL/kg，每只約3 mL，高劑量組給藥量為20 mL/kg，每只約6 mL。染毒結(jié)束次日，空白組和模型組每日予生理鹽水灌胃，每日2次；中藥高劑量組予6 mL濃煎劑灌胃，每日2次；中藥低劑量組予3 mL濃煎劑灌胃，每日2次；西藥組予7.5%的鹽酸氨溴索灌胃，每日2次。連續(xù)給藥9天。

2.4 標(biāo)本采集與處理

2.4.1 ELISA檢測(cè)

于末次給藥后24 h將各組大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，心臟取血于2 mL離心管中，室溫靜置1～2 h，離心后取上清并分裝，存放于-20 ℃冰箱待用。1周內(nèi)使用相應(yīng)試劑盒進(jìn)行酶聯(lián)免疫標(biāo)記，后用ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀讀取吸光值并計(jì)算結(jié)果。

2.4.2 病理學(xué)分析

脊椎脫臼法處死大鼠，取新鮮右肺，迅速轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，用切片機(jī)將各組組織蠟塊切成4 μm厚度切片，HE染色后予中性樹(shù)膠封片，編號(hào)并妥善保存。在光學(xué)顯微鏡200倍視野下觀察肺組織病理變化，共觀察10個(gè)視野，按如下評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5-8]進(jìn)行肺組織病理評(píng)分：1)肺泡腔融合面積占比(a)：無(wú)，記0分；0%20%，記3分。2)纖維細(xì)胞占比(b)：b≤25%，記0分；25%75%，記3分。3)漿細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目：無(wú)，記0分；少量，記1分；較多；記2分；顯著，記3分。4)肺間質(zhì)單核細(xì)胞數(shù)目：無(wú)，記0分；少量，記1分；較多；記2分；顯著，記3分。5)肺泡壁水腫情況：無(wú)水腫，記0分；輕度水腫，記1分；中度水腫，記2分；廣泛水腫，記3分。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 一般情況比較

各組大鼠均無(wú)死亡。染毒開(kāi)始后，各組大鼠毛發(fā)光澤度未見(jiàn)明顯區(qū)別，但空白組體型生長(zhǎng)速度及活躍程度明顯優(yōu)于各染毒組，整個(gè)染毒過(guò)程中染毒大鼠均出現(xiàn)鼻尖干裂情況,個(gè)別大鼠伴隨少量出血，可于3～4 d后自行消失。藥物干預(yù)后，中藥高、低劑量組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)速度呈恢復(fù)趨勢(shì)，而模型組、西藥組體質(zhì)量增長(zhǎng)率并無(wú)明顯變化。見(jiàn)表1。

表1 不同階段各組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率比較

3.2 肺組織結(jié)構(gòu)變化比較

如圖1顯示，空白組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，肺泡分布均勻，總體可見(jiàn)輕度小血管擴(kuò)張、肺間質(zhì)有極少量漿細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、極少量纖維細(xì)胞增生，肺泡壁斷裂及肺泡腔融合不顯(A1)。模型組大鼠肺組織呈嚴(yán)重炎性改變，可見(jiàn)明顯肺泡間隔增寬、肺間質(zhì)見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)，少量纖維細(xì)胞增生(A2)。中藥低劑量組、西藥組大鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)較完整，可見(jiàn)局部肺泡壁斷裂，伴有少量出血和滲出的現(xiàn)象，部分肺間質(zhì)及支氣管周圍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及充血(A3、A5)。中藥高劑量組肺組織可見(jiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，肺間質(zhì)見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞漿細(xì)胞浸潤(rùn)(A4)。肺組織評(píng)分比較結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果(×200)

表2 各組大鼠模型肺組織評(píng)分比較分)

3.3 大鼠血清中IFN-γ、MDA表達(dá)水平比較

與空白組比較，模型組血清中IFN-γ、MDA含量顯著上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，中藥低劑量組、西藥組血清中IFN-γ、MDA含量均有下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中藥高劑量組血清中IFN-γ、MDA含量較模型組降低。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清中IFN-γ、MDA表達(dá)水平比較

4 討論

PM2.5顆粒是空氣動(dòng)力學(xué)直徑≤2.5 μm的顆粒物，最主要來(lái)源是煤炭燃燒、機(jī)動(dòng)車尾氣、煙草煙霧等，其特征是體積小、重量輕，在大氣中滯留時(shí)間長(zhǎng)，可直接進(jìn)入肺泡并沉積，并可通過(guò)肺泡吸收入血引起氧化應(yīng)激炎性反應(yīng)，影響機(jī)體特異性免疫反應(yīng)及非特異性免疫反應(yīng)，有害成分可隨循環(huán)系統(tǒng)對(duì)人體多臟器產(chǎn)生損傷，對(duì)多種疾病發(fā)病率、住院率、病死率存在明顯影響。PM2.5顆粒可導(dǎo)致一定程度的肺病理變化，主要表現(xiàn)為炎性改變：支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、間質(zhì)淤血水腫、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肺纖維化肺組織形態(tài)學(xué)改變[9]。因此肺組織形態(tài)學(xué)改變可以直接反映PM2.5顆粒對(duì)呼吸系統(tǒng)的病理影響，是探究中藥對(duì)霧霾所致呼吸系統(tǒng)疾病療效的重要依據(jù)。

IFN-γ是由Th1細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子,主要介導(dǎo)與局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答,是創(chuàng)傷或感染后機(jī)體最早產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子之一,能顯著增加肺單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等MHCⅡ類抗原的表達(dá),增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞與T細(xì)胞的相互作用,使細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能增強(qiáng),導(dǎo)致肺組織細(xì)胞損害[10]。此外，IFN-γ不僅可直接作用于肺組織細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞,還可以誘導(dǎo)同樣能直接損傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的TNF-α因子的表達(dá)[11]，同時(shí)又誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放IL-1、IL-6、IL-8等細(xì)胞因子，進(jìn)而再度激活炎癥效應(yīng)細(xì)胞，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[12]。大鼠體內(nèi)IFN-γ因子的表達(dá)水平是反映PM2.5顆粒對(duì)肺組織損傷機(jī)制的重要指標(biāo)。

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的重要產(chǎn)物之一，可作為氧化應(yīng)激的標(biāo)志，由活性氧降解多不飽和脂肪酸而生成[13]。在肺損傷發(fā)展過(guò)程中，氧自由基的釋放可產(chǎn)生大量脂質(zhì)過(guò)氧化物，破壞細(xì)胞的膜性結(jié)構(gòu)，增加肺泡上皮細(xì)胞及肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，促進(jìn)肺水腫的發(fā)生[14]。檢測(cè)藥物干預(yù)前后PM2.5大鼠模型體內(nèi)MDA水平，對(duì)探究霧霾方對(duì)PM2.5大鼠模型的干預(yù)機(jī)制具有重要意義。

本研究顯示，造模后，模型組大鼠肺組織病理改變顯著，血清中IFN-γ、MDA水平顯著升高，這表明PM2.5所致大鼠肺損傷過(guò)程中可釋放大量氧自由基，產(chǎn)生大量脂質(zhì)過(guò)氧化物，同時(shí)刺激TH1細(xì)胞分泌IFN-γ，進(jìn)一步“級(jí)聯(lián)放大”炎癥信號(hào)，導(dǎo)致肺組織細(xì)胞損害，同時(shí)說(shuō)明PM2.5混懸液鼻腔滴注法可成功建立PM2.5所致肺損傷模型。中藥低劑量組與模型組比較，肺組織評(píng)分、IFN-γ水平、MDA水平均顯著降低，說(shuō)明霧霾方可以通過(guò)降低IFN-γ的表達(dá)而抑制染毒大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)；同時(shí)可以初步推斷，本方可以通過(guò)增強(qiáng)肺組織的抗氧化能力減少氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，從而減輕PM2.5顆粒對(duì)肺組織的損傷作用。其中中藥高劑量組的IFN-γ、MDA的水平較模型組雖有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明不同劑量的中藥治療組對(duì)PM2.5所致大鼠肺損傷均有一定影響，但具體的量-效關(guān)系需進(jìn)一步研究。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，PM2.5為代表的霧霾污染屬于“濁毒”范疇，是外邪的侵襲，能夠損傷人體肺衛(wèi)功能，在體內(nèi)產(chǎn)生病理產(chǎn)物，進(jìn)一步對(duì)其他臟腑產(chǎn)生影響[15]?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》曰：“正氣存內(nèi)，邪不可干”，采用中醫(yī)藥預(yù)防性治療PM2.5接觸患者，將有益于提高該部分群體的環(huán)境適應(yīng)能力，加強(qiáng)機(jī)體排毒解毒功能。江蘇省中醫(yī)院呼吸科主任醫(yī)師史鎖芳教授經(jīng)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐，認(rèn)為霧霾(PM2.5)作為“濁毒”侵害人體，可在體內(nèi)進(jìn)一步形成痰濕、瘀毒；易感人群辨證屬肺脾氣虛。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，以中醫(yī)理論剖析“霧霾大鼠模型”實(shí)為“痰濕礙脾、濁毒傷肺”之證，脾胃運(yùn)化功能失常，因而模型大鼠可見(jiàn)明顯的生長(zhǎng)減緩，與中醫(yī)理論相符。因此，擬“健脾化痰、解毒護(hù)肺方”，意在用健脾潤(rùn)肺法扶土生金以固本，兼顧化痰祛濕解毒而治標(biāo)，可恢復(fù)脾臟運(yùn)化、肺之宣肅。方中桑白皮清瀉肺熱，黃芪、白術(shù)益氣健脾，薏苡仁、冬瓜子、法半夏除濕化痰，桔梗、苦杏仁理肺祛痰止咳，蘆根、瓜蔞皮潤(rùn)肺利咽，桃仁、陳皮、皂角刺理氣活血、祛瘀解毒，炙甘草調(diào)和藥性，諸藥合用，可收扶助正氣、祛除濁毒之功，為中醫(yī)藥防治PM2.5誘發(fā)癥研究開(kāi)辟了新的研究思路。