結(jié)直腸癌組織中miR-92b-3p、FBXW7的表達(dá)變化及臨床意義

張文天，劉杰，杜錦波

滄州市人民醫(yī)院，河北滄州 061000

結(jié)直腸癌是源自腸道上皮的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中分別居第三位和第四位，對(duì)人類生命安全造成巨大危害[1]。結(jié)直腸癌起病隱匿，初期常無(wú)特異癥狀且易轉(zhuǎn)移，多數(shù)患者確診時(shí)癌癥已經(jīng)處于進(jìn)展期，手術(shù)效果較差，病死率和復(fù)發(fā)率均較高[2]。因此，進(jìn)一步探尋結(jié)直腸癌的病變機(jī)制及關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)研發(fā)靶向藥物和早期篩查至關(guān)重要。微小RNA(miRNA)是一類在真核生物中常見(jiàn)的非編碼RNA，其與3′非翻譯區(qū)結(jié)合后能夠調(diào)控轉(zhuǎn)錄及翻譯過(guò)程，參與細(xì)胞增殖和凋亡等[3]。miR-92b-3p屬于miR-25家族，參與合成mRNA-蛋白復(fù)合物，在細(xì)胞周期中調(diào)控G1/S期，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[4]。相關(guān)研究[5]表明，miR-92b-3p在多種癌組織中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)介導(dǎo)PI3K/Akt通路促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移。FBXW7是一種抑癌基因，位于4號(hào)染色體q31，其表達(dá)缺失或功能紊亂可以導(dǎo)致染色體不穩(wěn)及腫瘤發(fā)生率提高[6]。FBXW7主要受蛋白激酶C調(diào)控，通過(guò)靶向泛素化使多種轉(zhuǎn)錄激活因子及其癌蛋白失活，在腫瘤轉(zhuǎn)移、輔助診斷以及耐藥性等方面具有重要作用[7]。但miR-92b-3p和FBXW7在結(jié)直腸癌中的研究較少。因此，本研究觀察了結(jié)直腸癌組織中miR-92b-3p和FBXW7的表達(dá)情況，并探討其臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年4月～2019年5月我院收治的153例結(jié)直腸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者診斷符合《世界衛(wèi)生組織腫瘤分類診斷系統(tǒng)》[8]中的標(biāo)準(zhǔn)且經(jīng)術(shù)后病理確診為結(jié)直腸腺癌；均首次診斷為結(jié)直腸癌，且既往未接受過(guò)腸道手術(shù)或放化療；患者基本信息及病理資料完整，且同意配合本次試驗(yàn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并肛周瘺口、結(jié)腸穿孔、克羅恩病以及腸道結(jié)核等嚴(yán)重腸道疾病者；伴有其他原發(fā)惡性腫瘤(如膠質(zhì)瘤、胃癌以及乳腺癌等)者；肝腎功能失代償者；伴有先天遺傳缺陷者。其中男83例、女70例，年齡(56.29±8.51)歲；高分化89例、中分化51例、低分化13例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移128例；臨床分期Ⅰ期63例、Ⅱ期60例、Ⅲ期21例、Ⅳ期9例；腫瘤直徑≤5 cm者81例，>5 cm者72例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移19例，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移134例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情同意。

1.2 結(jié)直腸癌組織中miR-92b-3p、FBXW7表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。術(shù)中分別采集癌組織及其癌旁5 cm處正常結(jié)腸組織，先在液氮中暫存，術(shù)后統(tǒng)一置于-80 ℃冰箱中。以上組織各取50 mg，先于冰上研磨，然后各加入1 mL TRIzol試劑(Invitrogen公司，批號(hào):20170326)，依照操作規(guī)范提取總RNA。采用RT Enzyme Mix(Abcam公司，批號(hào):20170322)將提取的10 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green Mix試劑盒(Thermo公司，批號(hào)20170329)定量檢測(cè)miR-92b-3p和FBXW7。反轉(zhuǎn)錄時(shí)miR-92b-3p和FBXW7的反應(yīng)條件均為42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。miR-92b-3p的正向引物序列為5′-ACACTCCAGCTGGGTATTGCACTCGTCCCGGC-3′、反向引物序列為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGAGGCC-3′;內(nèi)參基因U6的正向引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、反向引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；FBXW7正向引物序列為5′-CGAACTCCAGTAGTATTGTGGACCT-3′、反向引物序列為5′-TTCTTTTCATTTTTGTTGTTTTTGTATAGA-3′;內(nèi)參基因GAPDH正向引物序列為5′-GCCGCATCTTCTTTTGCGTCGC-3′、反向引物序列為5′-TCCCGTTCTCAGCCTTGACGGT-3′。以上引物序列均由上海生工生物公司合成。miR-92b-3p和FBXW7的PCR反應(yīng)體系為SYBR Green Mix 10 μL、正反向引物均為1 μL、dH2O 8 μL、cDNA template 1 μL，共計(jì)20 μL。miR-92b-3p和FBXW7的PCR反應(yīng)條件均為預(yù)變性95 ℃ 2 min、變性94 ℃ 20 s、退火58 ℃ 20 s、延伸72 ℃ 20 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本均測(cè)量3次。以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-92b-3p和FBXW7的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織及其癌旁正常組織中miR-92b-3p、FBXW7表達(dá)比較 結(jié)直腸癌組織及其癌旁正常組織中miR-92b-3p的相對(duì)表達(dá)量分別為7.82±1.53、1.69±0.71，而FBXW7的相對(duì)表達(dá)量分別為0.36±0.13、0.98±0.42。結(jié)直腸癌組織中miR-92b-3p相對(duì)表達(dá)量較癌旁正常組織高，F(xiàn)BXW7的相對(duì)表達(dá)量較癌旁正常組織低(t=44.954、17.443，P均<0.01)。

2.2 miR-92b-3p、FBXW7表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見(jiàn)表1。

表1 miR-92b-3p、FBXW7表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 結(jié)直腸癌組織中miR-92b-3p和FBXW7表達(dá)的相關(guān)性 結(jié)直腸癌組織中miR-92b-3p和FBXW7的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.751，P=0.000)。

3 討論

結(jié)直腸癌是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，其年均新增病例約140萬(wàn)，且病死率在癌癥中位居第四位，對(duì)人類健康造成巨大危害[9]?；蛞赘行浴⒓易暹z傳、飲食習(xí)慣以及地域差異均能夠影響結(jié)直腸癌的發(fā)生。手術(shù)聯(lián)合化療是目前治療結(jié)直腸癌的常見(jiàn)手段，但由于早期診斷困難、癌癥易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，因此療效較差。據(jù)相關(guān)研究[10]報(bào)道，早期診斷的結(jié)直腸癌患者5年存活率約為90%，然而，癌胚抗原(CEA)及糖類抗原(CA19-9)等腫瘤標(biāo)志物的敏感度和特異性均較低，因此深入發(fā)掘結(jié)直腸癌病變機(jī)制及找尋關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)早期診斷和延長(zhǎng)患者生存時(shí)間意義重大。隨著表觀遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，非編碼RNA、DNA甲基化、DNA磷酸化以及組蛋白修飾等過(guò)程均被證明能夠使信號(hào)傳導(dǎo)通路異常，使原癌基因和抑癌基因功能紊亂，在腫瘤發(fā)生及進(jìn)展中起重要作用[11,12]。

miRNA是由18～25個(gè)核苷酸組成的短鏈小RNA，其不能編碼蛋白質(zhì)且具有高度保守性，但能夠結(jié)合3′端的非編碼區(qū)對(duì)細(xì)胞分化、增殖及遷移等過(guò)程起到調(diào)控作用。miRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)比較復(fù)雜，其序列突變、表達(dá)異常以及甲基化均會(huì)導(dǎo)致miRNA功能失調(diào)，進(jìn)而使細(xì)胞增殖、分化及凋亡等過(guò)程發(fā)生紊亂，增加正常細(xì)胞演變?yōu)槟[瘤細(xì)胞的概率[13]。miR-92b屬于miR-25家族，由miR-92b-3p和miR-92b-5p兩條miRNA分子組成，其中miR-92b-3p能夠進(jìn)入mRISC中進(jìn)而促進(jìn)miRNA成熟[14]。既往研究[15]表明，miR-92b-3p能夠通過(guò)抑制其靶基因p57，從而導(dǎo)致許多抑癌基因甲基化，使癌細(xì)胞異常增殖。本研究結(jié)果表明，結(jié)直腸癌組織中miR-92b-3p的相對(duì)表達(dá)量較癌旁正常組織高，其原因可能為癌組織中的原癌基因c-myc表達(dá)上調(diào)，通過(guò)結(jié)合miR-92b-3p啟動(dòng)子區(qū)域的E-box位點(diǎn)誘導(dǎo)miR-92b-3p表達(dá)，使miR-92b-3p表達(dá)提高[16]。本研究結(jié)果表明，結(jié)直腸癌組織中miR-92b-3p的表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度有關(guān)，且惡性度越高，其表達(dá)量越高。其機(jī)制可能為miR-92b-3p通過(guò)抑制抑癌基因NLK和DKK3，進(jìn)而調(diào)節(jié)Wnt/Beta-catenin信號(hào)通路，增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力[17]。當(dāng)抑制miR-92b-3p時(shí)，癌細(xì)胞的細(xì)胞周期受阻，癌細(xì)胞的克隆和增殖能力減弱[17]，表明miR-92b-3p對(duì)癌癥的分化、侵襲和轉(zhuǎn)移起促進(jìn)作用。

FBXW7屬于F-box蛋白家族，由F-box結(jié)構(gòu)域、D結(jié)構(gòu)域以及WD40重復(fù)序列組成，可以通過(guò)連接SKP1并結(jié)合SCF復(fù)合物，使多種靶蛋白泛素化及降解。既往研究[18]表明，c-myc、Notch、細(xì)胞周期蛋白E(cyclin E)以及Presenilin等基因均是SCF FBXW7 E3連接酶的底物，通過(guò)調(diào)控其表達(dá)使FBXW7在細(xì)胞分裂、分化及維持細(xì)胞干性等途徑中起關(guān)鍵作用，降低細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果表明，結(jié)直腸癌組織中FBXW7的相對(duì)表達(dá)量較癌旁正常組織低，其原因可能為癌細(xì)胞的基因缺失、基因突變以及啟動(dòng)子甲基化相互作用，共同導(dǎo)致癌組織中的FBXW7表達(dá)下調(diào)[19]。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)BXW7的表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度有關(guān)，且惡性度越高，其表達(dá)越低，表明FBXW7能夠抑制惡性腫瘤進(jìn)展，且可能作為判斷病情程度的依據(jù)。其原因可能為FBXW7的外顯子能夠直接結(jié)合p53，使蛋白酶通過(guò)泛素化靶向降解多種原癌基因產(chǎn)物，抑制癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，最終阻斷或延緩癌細(xì)胞侵襲或轉(zhuǎn)移[18]。此外，F(xiàn)BXW7還可以抑制cyclin E，維持染色體相對(duì)穩(wěn)定，避免染色體損傷或發(fā)生基因突變，而在癌組織中，F(xiàn)BXW7表達(dá)下降，對(duì)cyclin E的負(fù)性調(diào)控能力減弱，進(jìn)而使癌細(xì)胞易于分化及侵襲[20]。

本研究結(jié)果顯示，癌組織中的miR-92b-3p和FBXW7表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明miR-92b-3p可能靶向調(diào)控FBXW7，使其表達(dá)下調(diào)從而促進(jìn)腫瘤形成和進(jìn)展。其機(jī)制可能為miR-92b能夠結(jié)合FBXW7的3′非編碼區(qū)，進(jìn)而抑制其表達(dá)，加速癌細(xì)胞侵襲。c-myc與FBXW7呈負(fù)反饋調(diào)節(jié)，而c-myc則可以誘導(dǎo)miR-92b-3p表達(dá)，間接表明miR-92b-3p與FBXW7呈負(fù)相關(guān)[21]。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中miR-92b-3p表達(dá)增加，而FBXW7表達(dá)降低，二者均與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及分化程度有關(guān)，未來(lái)可能作為臨床評(píng)估患者病情進(jìn)展程度及藥物治療的靶點(diǎn)。