GRK5對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

紀(jì)曉楠,李勇,李恩杰

本溪市中心醫(yī)院，遼寧本溪 117000

乳腺癌是全球女性中最常見的惡性腫瘤，占2018年新診斷癌癥病例總數(shù)的24%，是2018年癌癥死亡的最常見原因(占總數(shù)的15%)[1]。隨著社會(huì)、經(jīng)濟(jì)環(huán)境的變化等，乳腺癌的發(fā)病率仍呈上升趨勢(shì)。雖然乳腺癌的治療手段在不斷的進(jìn)步，但是患者預(yù)后仍然較差[2]。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和化療耐藥導(dǎo)致的復(fù)發(fā)是乳腺癌患者死亡的主要原因[3]。因此研究乳腺癌惡性進(jìn)展的分子機(jī)制以探索新的治療途徑，對(duì)改善患者的生存期和生存質(zhì)量均具有重大的意義。G蛋白偶聯(lián)受體激酶5(GRK5)位于10q26.11染色體上，廣泛分布在多種類型細(xì)胞中，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，具有重要的生理功能。GRK5表達(dá)異常涉及多種疾病過程，包括糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和帕金森病等[4～6]。GRK5在腎透明細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌和前列腺癌等腫瘤中同樣發(fā)揮重要作用，與腫瘤增殖、侵襲和耐藥等密切相關(guān)，可促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展，可能是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)[7～9]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)GRK5與乳腺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇化療敏感性增加有關(guān)[10]。因此2017年10月～2019年6月本研究探討了GRK5對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和紫杉醇化療敏感性的影響，并初步探討其發(fā)揮作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-435S購于美國ATCC細(xì)胞庫；培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、6孔板和96孔板等購于美國Coring公司；L-15和FBS購于美國Gibco公司；GRK5 siRNA購于上海銳博生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑購自北京東仁化學(xué)科技有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物公司；強(qiáng)效RIPA裂解液購于北京索萊寶公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購于美國Thermo公司；PVDF膜購于美國Promega公司；GRK5、P53、MDM2和GAPDH抗體購自英國Abcam公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Millipore公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染 MDA-MB-435S細(xì)胞復(fù)蘇后重懸于含有10% FBS的L-15培養(yǎng)基中，放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度為95%左右時(shí)，以2.0×105個(gè)/孔接種于6孔板中，分為si-NC組和si-GRK5組，細(xì)胞接種12 h后采用脂質(zhì)體2000按說明書進(jìn)行各組轉(zhuǎn)染，NC siRNA與脂質(zhì)體2000混合后加至si-NC組細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，GRK5 siRNA與脂質(zhì)體2000混合后加至si-GRK5組細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究。

1.3 細(xì)胞GRK5蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。收集兩組轉(zhuǎn)染48 h的MDA-MB-435S細(xì)胞，加入RIPA裂解液完全裂解后，離心去除細(xì)胞碎片。將上清液移至新的EP管中，BCA檢測(cè)蛋白濃度。蛋白裂解液中加入上樣緩沖液進(jìn)行煮沸變性，SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)，封閉液室溫孵育1 h后，加入GRK5一抗稀釋液4 ℃孵育過夜。TBST洗3次，二抗稀釋液室溫孵育2 h。采用ECL試劑盒曝光條帶。采用Image J軟件測(cè)量GRK5蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的條帶的相對(duì)表達(dá)量(目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值)。

1.4 細(xì)胞增殖能力測(cè)算 采用CCK-8實(shí)驗(yàn)。將si-NC組和si-GRK5細(xì)胞按1 000個(gè)/孔接種于96孔板中，各組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別在轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h時(shí)，每孔加入10 μL的CCK-8試劑。細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)處的光密度(OD)值，以O(shè)D值代表細(xì)胞增殖能力。

1.5 細(xì)胞遷移能力觀察 采用劃痕實(shí)驗(yàn)。將si-NC組和si-GRK5組細(xì)胞按4×105個(gè)/孔接種于6孔板中，各組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞融合度為98%左右時(shí)，用劃痕器在6孔板正中間垂直劃一條劃痕，洗去脫落的細(xì)胞，顯微鏡下觀察劃痕寬度，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后顯微鏡下觀察劃痕寬度變化。劃痕愈合比=1-(24 h劃痕寬度/0 h劃痕寬度)%。劃痕愈合比代表細(xì)胞的遷移能力，即劃痕愈合比越大，其遷移能力越強(qiáng)。

1.6 細(xì)胞凋亡率測(cè)算 無EDTA胰酶消化收集si-NC組和si-GRK5組轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，PBS洗3次后，按照細(xì)胞凋亡染色試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞染色，每管細(xì)胞為5×105個(gè)，每組有3個(gè)復(fù)孔，染色后采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡率檢測(cè)。

1.7 細(xì)胞紫杉醇化療敏感性觀察 采用CCK-8實(shí)驗(yàn)。將si-NC組和si-GRK5組細(xì)胞按2 000個(gè)/孔接種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在接種12 h細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度(0、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μg/mL)的紫杉醇處理細(xì)胞48 h，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。每孔加入10 μL的CCK-8試劑，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)處的OD值。細(xì)胞生長(zhǎng)存活率=(各加藥組OD值/各不加藥組OD值)，計(jì)算紫杉醇作用MDA-MB-435S細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.8 細(xì)胞P53、MDM2和MMP2蛋白檢測(cè) 參照1.3。

2 結(jié)果

2.1 兩組GRK5蛋白表達(dá)比較 si-NC組、si-GRK5組GRK5蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.74±0.08、0.25±0.03，兩組比較P<0.05。

2.2 兩組細(xì)胞增殖能力比較 見表1。

表1 兩組細(xì)胞增殖能力比較

2.3 兩組細(xì)胞遷移能力比較 si-NC組、si-GRK5組細(xì)胞劃痕愈合比分別為(22.64±9.05)%、(6.25±2.02)%,兩組比較P<0.05。

2.4 兩組細(xì)胞凋亡率比較 si-NC組、si-GRK5組細(xì)胞凋亡率分別為(9.24±2.57)%、(21.64±8.51)%,兩組比較P<0.05。

2.5 兩組紫杉醇化療敏感性比較 0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μg/mL紫杉醇處理si-NC組細(xì)胞生長(zhǎng)存活率分別為(100±1.25)%、(98.36±4.23)%、(93.51±5.36)%、(88.24±7.98)%、(81.62±10.35)%、(74.26±9.20)%、(61.60±3.24)%、(50.95±6.24)%、(39.11±6.95)%、(28.42±0.95)%，si-GRK5組分別為(100±0.46)%、(94.12±5.01)%、(80.32±3.25)%、(79.04±10.09)%、(62.41±2.62)%、(51.64±9.42)%、(42.54±3.51)%、(30.16±9.51)%、(14.25±3.01)%、(6.21±1.04)%。紫杉醇對(duì)si-NC組、si-GRK5組的IC50值分別為16.22±2.54、7.43±1.25，兩組比較P<0.05。

2.6 兩組P53、MDM2、MMP2蛋白表達(dá)比較 si-NC組P53、MDM2、MMP2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.03、1.00±0.04、1.00±0.02，si-GRK5組分別為7.41±0.73、0.18±0.03、0.36±0.05，兩組比較P均<0.05。

3 討論

乳腺癌是女性中最常見的癌癥，在全世界范圍內(nèi)具有高發(fā)病率和病死率[1]。傳統(tǒng)的治療策略(包括手術(shù)、放療或化學(xué)療法)已被廣泛用于乳腺癌患者，其中紫杉醇等藥物是治療乳腺癌的一線化療藥物。乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病，具有不同的病理和分子特征，這使得大部分患者后期對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥[3]。目前除了傳統(tǒng)治療方法以外，對(duì)于激素依賴性的乳腺癌患者可采用激素療法，以及對(duì)于具有已知藥物靶點(diǎn)的乳腺癌患者進(jìn)行靶向分子治療。靶向治療是針對(duì)腫瘤細(xì)胞的高度特異性的新型治療方法，不良反應(yīng)較小，但是大部分乳腺癌患者不表達(dá)激素受體和不具有已知藥物的分子靶點(diǎn)，以及存在化療和靶向藥物的耐藥，使得乳腺癌患者預(yù)后仍然不盡人意[11]。尋找可靠有效的治療靶標(biāo)解決乳腺癌耐藥和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為是目前的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。

GRK屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，可以識(shí)別和磷酸化抑制包括腎上腺素能、毒蕈堿、多巴胺和趨化因子受體等G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)，從而導(dǎo)致它們的脫敏作用[12]。多項(xiàng)研究表明，在腫瘤等多種病理狀況下，GRKs的表達(dá)和活性均受到損害。目前已鑒定出7種GRK的亞型(GRK1～7)，其中GRK5是一種多功能蛋白，能夠響應(yīng)各種刺激而在細(xì)胞內(nèi)移動(dòng)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵信號(hào)，從細(xì)胞膜上的受體激活到細(xì)胞核中的基因轉(zhuǎn)錄。研究[13]報(bào)道，GRK5能夠通過使GPCRs和非GPCRs受體脫敏來抑制癌癥進(jìn)展，并誘導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)。GRK5在多種腫瘤中高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的生物學(xué)行為，Zhao等[7]報(bào)道，與配對(duì)的相鄰非腫瘤組織相比，腎細(xì)胞癌組織具有更高的GRK5表達(dá)，并與患者不良預(yù)后有關(guān)，敲低GRK5降低腎細(xì)胞癌細(xì)胞系的活力、侵襲和遷移能力，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G1期。GRK5在非小細(xì)胞肺癌癌組織中同樣表達(dá)增加，耗竭GRK5可以抑制腫瘤癌細(xì)胞的增殖、體外遷移和體內(nèi)異種移植腫瘤形成的能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯在G2/M期[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與si-NC組相比，si-GRK5組乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移的能力降低，細(xì)胞凋亡率升高。表明GRK5在乳腺癌中發(fā)揮癌基因作用，與在腎細(xì)胞癌和非小細(xì)胞肺癌中的研究一致[7,8]。Lagman等[10]研究報(bào)道，乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中GRK5表達(dá)降低，對(duì)紫杉醇凋亡效應(yīng)的敏感性增加。紫杉醇在臨床上是治療轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)乳腺癌患者的一線化療藥物，但是腫瘤細(xì)胞對(duì)其具有較高的耐藥性[14]。本文同樣發(fā)現(xiàn)，干擾GRK5的表達(dá)，乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435S對(duì)紫杉醇的敏感性增加。GRK5促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展，但是發(fā)揮的作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。目前提示GRK5促進(jìn)腫瘤發(fā)生的證據(jù)是其抑制P53的表達(dá)[13]。P53是一種重要的腫瘤抑制因子，可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯或凋亡，P53與其抑制因子E3泛素連接酶MDM2形成的P53/MDM2密切調(diào)控腫瘤的增殖和凋亡及依賴凋亡途徑的耐藥作用[15]。此外，MMP2是通過降解細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)腫瘤侵襲遷移的重要蛋白[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與si-NC組相比，si-GRK5組細(xì)胞中P53蛋白表達(dá)增加，MDM2和MMP2蛋白表達(dá)降低，表明GRK5通過調(diào)控P53/MDM2信號(hào)通路促進(jìn)MMP2的表達(dá)參與乳腺癌的惡性進(jìn)展。

綜上所述，干擾GRK5的表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生和對(duì)紫杉醇的敏感性，這可能是通過調(diào)控P53/MDM2信號(hào)通路的激活和MMP2蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。