金蕎麥提取物對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠氧自由基的影響

潘朝旺，楊家林，輯丹菊，萬(wàn)進(jìn)軍

（鄂州職業(yè)大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 鄂州436099）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是在力學(xué)和生物學(xué)等因素的共同作用下，軟骨組織正常分解和合成代謝失衡，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞死亡、基質(zhì)降解、軟骨組織破壞的一種系統(tǒng)性疾病，目前其確切病因仍不明確，近年來(lái)研究提示OA的發(fā)生發(fā)展與氧自由基關(guān)系密切[1-2]，發(fā)生在膝關(guān)節(jié)的骨關(guān)節(jié)炎稱為膝骨關(guān)節(jié)炎。本課題組之前在金蕎麥對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎兔作用的研究中，提示其對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎兔關(guān)節(jié)軟骨有保護(hù)作用[3]，為了進(jìn)一步探討其對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的作用，本研究擬通過(guò)觀察金蕎麥提取物對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清、關(guān)節(jié)液及關(guān)節(jié)軟骨超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、過(guò)氧化脂質(zhì)（LPO）的影響，探討其治療膝骨關(guān)節(jié)炎作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SD大鼠60只，清潔級(jí)，體重200±20g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，許可證號(hào):SCXK(川2013-24)。

1.2 藥物與試劑

金蕎麥提取物（每g相當(dāng)于原藥材20g），購(gòu)自西安草翠芯生物科技有限公司；抗骨增生膠囊，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司。SOD、MDA、LPO ELISA試劑盒，購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司。木瓜蛋白酶,購(gòu)自西安正東生物科技有限公司。

1.3 儀器

9602A酶標(biāo)儀，南京普朗醫(yī)用設(shè)備有限公司；UV754紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器公司；Z160M微量高速離心機(jī)，德國(guó)HERMLE。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模及分組給藥

取大鼠60只，隨機(jī)挑選10只作為正常組，其余50只參照文獻(xiàn)[4]制備骨關(guān)節(jié)炎模型：分別在第1、4、7天于大鼠雙側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射4%木瓜蛋白酶溶液0.2mL/肢，每天1次。將模型動(dòng)物隨機(jī)分為5組，每組10只，即模型組、抗骨增生膠囊組、金蕎麥低、中、高劑量組，加上前面的正常組共6組。最后一次注射木瓜蛋白酶后，給藥，金蕎麥低、中、高劑量組每天灌胃金蕎麥提取物0.135、0.270、0.540g/kg，抗骨增生膠囊組每天灌胃抗骨增生膠囊混懸液0.945g/kg，模型組和正常組每天灌胃生理鹽水5ml，連續(xù)給藥28天，末次給藥24小時(shí)后。觀察以下指標(biāo)。

2.2 ELISA法檢測(cè)血清SOD、MDA、LPO

末次給藥24h后，將大鼠用3%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉，固定，腹總動(dòng)脈取血約8mL/只，離心，制備血清。按試劑盒說(shuō)明采用ELISA法測(cè)定SOD、MDA、LPO含量。

2.3 ELISA法檢測(cè)關(guān)節(jié)液SOD、MDA、LPO

參照文獻(xiàn)[4]，將膝關(guān)節(jié)逐層分離至關(guān)節(jié)囊，通過(guò)反復(fù)活動(dòng)膝關(guān)節(jié)，將關(guān)節(jié)液擠壓至髕上囊內(nèi)側(cè)，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入0.5mL生理鹽水，抽取關(guān)節(jié)液。按試劑盒說(shuō)明采用ELISA法測(cè)定SOD、MDA、LPO含量。

2.4 ELISA法檢測(cè)軟骨組織SOD、MDA、LPO

取關(guān)節(jié)軟骨，剪碎，用生理鹽水1:20勻漿。按試劑盒說(shuō)明采用ELISA法測(cè)定SOD、MDA、LPO含量。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)用spss19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較用T檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 各組血清SOD、MDA、LPO比較

與正常組比較，模型組血清SOD含量明顯下降，而MDA、LPO明顯升高，差異有極顯著意義（P＜0.01）；與模型組比較，抗骨增生膠囊組、金蕎麥各劑量組血清SOD含量明顯升高，MDA、LPO明顯下降（P＜0.05或 P＜0.01），其中抗骨增生膠囊組、金蕎麥高、中劑量組差異有極顯著意義（P＜0.01），金蕎麥低劑量組差異有顯著意義（P＜0.05）。另外，金蕎麥高、中劑量組對(duì)SOD、MDA、LPO的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于抗骨增生膠囊組，金蕎麥中劑量組作用弱于高劑量組，但效價(jià)強(qiáng)度高于高劑量組，是3個(gè)劑量的最優(yōu)選擇。見(jiàn)表1。

表1 各組血清 SOD、MDA、LPO 比較（±S，n=10）

表1 各組血清 SOD、MDA、LPO 比較（±S，n=10）

注：與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01（下同）

組 別 劑量（g/kg） SOD （U/mL） MDA （nmoL/mL） LPO （nmoL/mL）正常組模型組抗骨增生膠囊組金蕎麥低劑量組金蕎麥中劑量組金蕎麥高劑量組生理鹽水生理鹽水0.945 0.135 0.270 0.540 113.54±28.45images/BZ_108_1265_1501_2309_1522.png53.38±14.58 84.62±19.30images/BZ_108_1244_1677_2288_1698.png76.43±18.41images/BZ_108_1244_1764_2288_1785.png93.84±24.36images/BZ_108_1244_1850_2288_1871.png98.28±22.52images/BZ_108_1244_1937_2288_1958.png6.46±2.09 15.24±3.80 8.80±3.19 10.68±4.19 8.75±3.13 8.22±3.34

3.2 各組關(guān)節(jié)液和關(guān)節(jié)軟骨組織SOD、MDA、LPO比較

同上述血清SOD、MDA、LPO相似，與正常組比較，模型組關(guān)節(jié)液和關(guān)節(jié)軟骨組織SOD含量明顯下降，而MDA、LPO明顯升高，差異有極顯著意義（P＜0.01）；與模型組比較，抗骨增生膠囊組、金蕎麥各劑量組關(guān)節(jié)液和關(guān)節(jié)軟骨組織SOD含量明顯升高，MDA、LPO明顯下降（P＜0.05或 P＜0.01）。金蕎麥各劑量中，中劑量組仍是效價(jià)強(qiáng)度最高。見(jiàn)表 2、表 3。

表2 各組關(guān)節(jié)液 SOD、MDA、LPO 比較（±S，n=10）

表2 各組關(guān)節(jié)液 SOD、MDA、LPO 比較（±S，n=10）

組 別 劑量(g/kg） SOD(U/mL） MDA(nmoL/mL） LPO(nmoL/mL）正常組模型組抗骨增生膠囊組金蕎麥低劑量組金蕎麥中劑量組金蕎麥高劑量組生理鹽水生理鹽水0.945 0.135 0.270 0.540 24.43±5.30images/BZ_108_1240_2677_2266_2697.png8.54±2.20 16.06±4.22images/BZ_108_1240_2849_2266_2869.png13.82±4.53images/BZ_108_1240_2934_2266_2954.png18.86±5.70images/BZ_108_1240_3019_2266_3039.png20.32±5.46images/BZ_108_1240_3104_2266_3124.png0.67±0.23images/BZ_108_1615_2677_2641_2697.png2.80±0.70 1.61±0.63images/BZ_108_1615_2849_2641_2869.png1.95±0.64images/BZ_108_1615_2934_2641_2954.png1.10±0.26images/BZ_108_1615_3019_2641_3039.png0.98±0.22images/BZ_108_1615_3104_2641_3124.png0.59±0.18 1.85±0.34 0.97±0.26 1.24±0.49 0.78±0.21 0.72±0.23

表3 各組膝關(guān)節(jié)軟骨組織SOD、MDA、LPO比較（±S，n=10）

表3 各組膝關(guān)節(jié)軟骨組織SOD、MDA、LPO比較（±S，n=10）

組 別 劑量（g/kg） S0D （U/mg） MDA （nmoL/mg） LP0 （nmoL/mg）正常組模型組抗骨增生膠囊組金蕎麥低劑量組金蕎麥中劑量組金蕎麥高劑量組生理鹽水生理鹽水0.945 0.135 0.270 0.540 4.48±0.69 8.76±0.90 6.04±0.53 7.38±0.74 5.35±0.72 5.06±0.83

4 討論

OA作為常見(jiàn)于中老年人的慢性退行性關(guān)節(jié)病損，嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量。目前，臨床上對(duì)于本病也沒(méi)有治愈的明確方法，原因是其具體的發(fā)病機(jī)制還不是十分清楚。已有的研究表明，生物應(yīng)力、激素代謝、先天遺傳因素，金屬原子、氧化應(yīng)激（自由基）、炎癥因子等因素被認(rèn)為與OA發(fā)病原因及病理發(fā)展密切相關(guān)[5]。

在上述因素中，氧化應(yīng)激是OA發(fā)生發(fā)展的非常重要因素，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)胞外基質(zhì)的合成和降解、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通道的傳導(dǎo)、基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯、細(xì)胞衰老和凋亡等過(guò)程，促進(jìn)OA病情的發(fā)展。而氧自由基是氧化應(yīng)激導(dǎo)致OA軟骨細(xì)胞損傷、衰老和凋亡的直接原因。氧自由基參與了維持細(xì)胞糖酵解的氧化還原平衡，從而維持關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞代謝的動(dòng)態(tài)平衡[6]。關(guān)節(jié)組織細(xì)胞微環(huán)境里穩(wěn)態(tài)平衡的氧自由基，對(duì)于維持其結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用[7]，但是，如果氧自由基代謝失衡，過(guò)量的氧自由基會(huì)導(dǎo)致軟骨細(xì)胞代謝失衡，抑制軟骨基質(zhì)蛋白多糖和膠原的合成，加速軟骨基質(zhì)的降解，引起細(xì)胞損傷。氧自由基作用于細(xì)胞脂膜，使多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，產(chǎn)生LPO，LPO通過(guò)正反饋攻擊生物膜導(dǎo)致惡性循環(huán)的細(xì)胞膜損傷，并誘使連鎖增殖反應(yīng)，形成降解產(chǎn)物MDA[8]，故LPO和MDA均為氧自由基引起脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，故二者是檢測(cè)氧自由基水平的常用指標(biāo)，它們含量的高低反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，間接反映骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度。SOD是氧自由基的清除劑，它的活力反映機(jī)體清除氧自由基的能力，從而保護(hù)損傷軟骨組織，減緩軟骨破壞，其濃度越高，表明骨關(guān)節(jié)炎損傷越小。本研究表明，OA病變過(guò)程中含量存在著氧自由基代謝的紊亂，金蕎麥提取物可明顯提高膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠血清、關(guān)節(jié)液和軟骨組織SOD含量，降低LPO、MDA的含量，改善氧自由基代謝平衡，減輕氧自由基對(duì)軟骨組織的損傷，從而保護(hù)軟骨組織。