微波輔助同步提取苦蕎中黃酮和多糖的工藝優(yōu)化

張歡，楊芙蓮，董丹

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，西安 710021)

苦蕎麥屬于雙子葉廖科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum)，又名韃靼蕎麥、烏麥或三角麥，既是一種重要的小宗雜糧作物，又是藥食兩用植物[1-3]?？嗍w麥的營養(yǎng)豐富，有碳水化合物、蛋白質(zhì)、葡萄糖、植物固醇、多酚類、維生素、亞油酸、油酸、類胡蘿卜素、礦物質(zhì)等，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他作物，其中黃酮類化合物、多糖和蛋白質(zhì)是主要的生物活性成分，具有降血糖、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒和預(yù)防心腦血管疾病等生物學(xué)功能[4-6]，且提取出來的黃酮和多糖可廣泛應(yīng)用于調(diào)味食品、保健食品等食品加工中，廣受人們的歡迎。目前苦蕎中黃酮類化合物的提取方法有：熱水提取、超聲波提取、微波提取和酶解等方法[7-9]；苦蕎中多糖的提取方法有：熱水提取、超聲波輔助提取和堿水提取等方法[10-12]，其提取物質(zhì)較單一，對于兩種物質(zhì)的同步提取研究較少。因此，本文以苦蕎為原料，采用微波輔助同步提取黃酮類化合物和多糖，為具有高營養(yǎng)附加值的苦蕎產(chǎn)品研究提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎麥：橫山縣陜北大地農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限責(zé)任公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：源葉生物有限公司；亞硝酸鈉(分析純)：天津市福晨化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉、硝酸鋁、無水乙醇(分析純)：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖(分析純)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸、苯酚(分析純)：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

儀器與設(shè)備見表1。

表1 儀器與設(shè)備表Table 1 Instrument and equipment

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

苦蕎→清洗→干燥→粉碎→過篩→烘烤→微波提取→離心→上清液→含黃酮和多糖的溶液。

1.3.2 操作要點(diǎn)

1.3.2.1 粉碎

將挑選無霉、完好的苦蕎清洗，干燥后用粉碎機(jī)粉碎過篩。

1.3.2.2 烘烤

將經(jīng)粉碎后的苦蕎細(xì)粉鼓風(fēng)干燥120 ℃烘烤30 min，可以增加苦蕎茶的香氣，但是要嚴(yán)格控制烘烤時間。

1.3.3 微波輔助苦蕎總黃酮和多糖同步提取的單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 液料比的選擇

在粉碎粒度為100目，微波功率為360 W，時間為90 s時，考察液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 (mL/g)時對苦蕎總黃酮和多糖得率的影響。

1.3.3.2 粉碎粒度的選擇

在液料比為20∶1 (mL/g)，微波功率為360 W，時間為90 s時，考察粉碎粒度分別為40，60，80，100，120目時對苦蕎總黃酮和多糖得率的影響。

1.3.3.3 微波功率的選擇

在液料比為20∶1 (mL/g)，粉碎粒度為100目，時間為90 s時，考察微波功率分別為180，360，540，720，900 W時對苦蕎總黃酮和多糖得率的影響。

1.3.3.4 微波時間的選擇

在液料比為20∶1 (mL/g)，粉碎粒度為100目，微波功率為360 W時，考察時間分別為30，60，90，120，150 s時對苦蕎總黃酮和多糖得率的影響。

1.3.4 微波輔助苦蕎總黃酮和多糖同步提取的響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)以上的單因素試驗(yàn)，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計方法，選取粉碎粒度、微波功率、微波時間3個因素，以苦蕎中黃酮和多糖得率為響應(yīng)值，運(yùn)用響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)，以獲取最佳工藝參數(shù)。數(shù)據(jù)處理采用Design-Expert 8統(tǒng)計軟件。因素水平編碼設(shè)計見表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平編碼表

1.3.5 黃酮和多糖得率的測定

黃酮含量的測定采用NaNO2-Al(NO)3比色法；多糖的測定采用苯酚硫酸法。

1.3.6 待測樣品的制備

稱取一定量的苦蕎粉，用蒸餾水溶解，置于微波爐中進(jìn)行微波提取，離心得到上清液，于100 mL容量瓶定容得到黃酮待測液；另外將粗多糖的提取液加入4倍體積的無水乙醇，靜置24 h，抽濾并收集沉淀，將沉淀于60 ℃烘干，得到苦蕎粗多糖，溶解后測多糖得率。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.1.1 黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)，經(jīng)最小二乘法可得到吸光度與蘆丁濃度之間的回歸方程為：A=12.585x-0.006，R2=0.9992，根據(jù)回歸方程計算總黃酮得率。

圖1 黃酮類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of flavonoids

2.1.2 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2)，經(jīng)最小二乘法可得到吸光度與葡萄糖濃度之間的回歸方程為：A=1.7257x+0.0347，R2=0.9995，根據(jù)回歸方程計算多糖得率。

圖2 多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Standard curve of polysaccharides

2.2 微波輔助苦蕎中總黃酮和多糖同步提取條件的選擇

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1 液料比的選擇

圖3 液料比對總黃酮和多糖得率的影響Fig.3 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of total flavonoids and polysaccharides

由圖3可知，隨著液料比的不斷增大，黃酮得率開始快速上升，當(dāng)液料比高于20∶1 (mL/g)后，上升速度變緩，可能是因?yàn)橐毫媳冗^大時，黃酮不能充分地溶解；多糖得率隨著液料比的增大逐漸下降，在液料比為20∶1 (mL/g)之前，緩慢下降，之后快速下降，因?yàn)殡S著水添加量的增多，使得其中的其他雜質(zhì)大量溶出，則多糖得率逐漸減小。隨著液料比的增加，多糖得率下降，這可能是因?yàn)殡S著液料比的增大，黃酮的溶出量增加，部分多糖隨之溶出，造成沉淀中多糖增加，致使多糖得率降低[13]。綜合考慮，選擇液料比為20∶1 (mL/g)較適宜。

2.2.1.2 粉碎粒度的選擇

圖4 粉碎粒度對總黃酮和多糖得率的影響Fig.4 Effect of crushing particle size on the yield of total flavonoids and polysaccharides

由圖4可知，總黃酮和多糖得率均隨著粉碎粒度的減小先增大后減小，當(dāng)粉碎粒度大于100目時，苦蕎中的黃酮和多糖得率逐漸增大；當(dāng)粉碎粒度為100目時，黃酮和多糖的得率都達(dá)到最大值；粉碎粒度小于100目時，黃酮和多糖的得率均開始下降，其中黃酮下降較平緩。

2.2.1.3 微波功率的選擇

圖5 微波功率對總黃酮和多糖得率的影響Fig.5 Effect of microwave power on the yield of total flavonoids and polysaccharides

由圖5可知，苦蕎黃酮和多糖得率在微波功率為360 W時達(dá)到最大值，其隨著微波功率的增大呈先增大后減小的趨勢。這可能是通過電磁波的輻射作用，使得物料的溫度升高，且壓力增大，進(jìn)而使細(xì)胞破碎，其有效成分流出并溶解，但功率過大，微波作用會破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使一些除黃酮和多糖之外的物質(zhì)溶解度增大，且溫度升高，導(dǎo)致部分多糖發(fā)生水解，進(jìn)而使得黃酮和多糖的得率下降[14]。

2.2.1.4 微波時間的選擇

圖6 時間對總黃酮和多糖得率的影響Fig.6 Effect of time on the yield of total flavonoids and polysaccharides

由圖6可知，苦蕎黃酮和多糖在微波時間為90 s時達(dá)到最大值，而后開始下降。這可能是因?yàn)橐欢〞r間的微波輻射導(dǎo)致細(xì)胞破碎，黃酮和多糖溶出量增大，但微波時間較長使得黃酮和多糖的穩(wěn)定性降低，并且微波時間延長，熱量聚集，破壞了黃酮和多糖的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而其得率減小[15]。

2.2.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定液料比的條件，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計原理，選擇粉碎粒度(A)、微波功率(B)、時間(C)進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析，確定總黃酮和多糖的最佳同步提取條件。試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表3。

表3 苦蕎黃酮得率響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 3 Response surface analysis scheme and results of tartary buckwheat flavonoids’ yield

2.2.3 建立模型方程與顯著性檢驗(yàn)

對該回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4和表5。采用Design-Expert 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，得到苦蕎黃酮和多糖得率二次多項(xiàng)回歸方程：黃酮得率=1.11+0.10A+0.075B+0.054C+0.071AB+0.071AC-0.058BC-0.16A2-0.19B2-0.18C2；多糖得率=11.78+1.34A+0.49B+1.02C-0.25AB+1.35AC-0.48BC-2.02A2-1.70B2-1.73C2。

表4 黃酮得率回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model of flavonoids' yield

續(xù) 表

表5 多糖得率回歸模型方差分析 Table 5 Variance analysis of regression model of polysaccharides’ yield

由回歸模型的方差分析結(jié)果可知，粉碎粒度、微波功率和二次項(xiàng)A2、B2、C2對黃酮得率的影響極顯著，時間和交互項(xiàng)AB、AC、BC對黃酮得率的影響顯著；因素A，B，C和交互項(xiàng)AC以及二次項(xiàng)A2、B2、C2對多糖得率的影響極顯著，交互項(xiàng)BC對多糖得率的影響顯著，而交互項(xiàng)AB對多糖得率的影響不顯著。

由表4和表5可知，黃酮和多糖的P值均<0.0001，表明響應(yīng)面回歸模型極顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。黃酮的信噪比Adeq Precision的值很高，為16.007，即該模型可用于預(yù)測；失擬項(xiàng)的F值為0.38，表明使用該方程進(jìn)行擬合的效果較好；模型的校正確定系數(shù)R2=0.9784，說明預(yù)測值與試驗(yàn)值之間有較好的相關(guān)性，試驗(yàn)誤差小。另外，多糖的信噪比Adeq Precision的值很高，為19.754，即該模型可用于預(yù)測；失擬項(xiàng)F值為2.60，表明使用該方程進(jìn)行擬合的效果較好；模型的校正確定系數(shù)R2=0.9873，說明預(yù)測值與試驗(yàn)值之間有較好的相關(guān)性，試驗(yàn)誤差小；因此，可用此模型對不同提取條件下苦蕎總黃酮得率進(jìn)行預(yù)測。

2.2.4 響應(yīng)曲面分析

圖7 各因素間交互作用對黃酮得率的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots of interaction between factors on flavonoids’ yield

圖8 各因素間交互作用對多糖得率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots of interaction between factors on polysaccharides’ yield

由圖7和圖8可知，響應(yīng)面圖及等高線圖比較直觀地反映了各因素及兩因素間的交互作用對黃酮和多糖得率的影響。由兩兩因素的交互作用的3D響應(yīng)面圖可知，各因素間的交互作用較強(qiáng)，其中曲線走勢越陡峭表明對響應(yīng)值的影響越顯著；反之越平滑影響越小[16]。其中黃酮和多糖的響應(yīng)面都有極值，也就是都有最高點(diǎn)。

通過Design-Expert 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，苦蕎黃酮和多糖的最佳同步提取條件為：液料比20∶1 (mL/g)、粉碎粒度為108目、微波功率為388 W、時間為99 s，得到的預(yù)測黃酮得率為1.138%，多糖得率為12.4%?？紤]實(shí)際操作，將試驗(yàn)條件修正為：液料比20∶1 (mL/g)，粉碎粒度為100目，微波功率為360 W，時間為99 s。

2.2.5 苦蕎黃酮和多糖最佳同步提取條件驗(yàn)證試驗(yàn)

在液料比20∶1 (mL/g)、粉碎粒度為100目，微波功率為360 W，時間為99 s的條件下，重復(fù)提取3次，測得黃酮得率為1.126%，多糖得率為12.38%，與預(yù)測值基本吻合，偏差較小。說明得到的回歸模型與實(shí)際情況擬合很好，進(jìn)一步驗(yàn)證了該模型的可行性。

3 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面分析，得到了苦蕎黃酮和多糖的同步最佳提取工藝條件為：液料比20∶1 (mL/g)、粉碎粒度為100目、微波功率為360 W、時間99 s，苦蕎黃酮得率為1.126%，多糖得率為12.38%。利用微波輔助同步提取苦蕎黃酮和多糖，相對于熱水提取來說，大大地縮短了提取時間，降低了提取成本，增加了經(jīng)濟(jì)效益，為進(jìn)一步研究苦蕎黃酮和多糖的同步提取提供了有益的參考。