C57BL/6J乳鼠心肌細(xì)胞的提取及鑒定*

張新會(huì)，羅文龍，裴漢軍

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 ，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

隨著老齡化的人口的加劇，心血管疾病正在成為危害人類健康的最大殺手，尤其病情兇險(xiǎn)的急性心肌梗死，可直接導(dǎo)致患者死亡[1]。隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，在細(xì)胞水平觀察心血管疾病發(fā)生及發(fā)展的機(jī)制，了解其中信號(hào)傳導(dǎo)、凋亡、以及蛋白表達(dá)相關(guān)情況，成為治療心血管疾病的新思路[2]。因而越來(lái)越多的生物實(shí)驗(yàn)研究需要原代心肌細(xì)胞的參與。高純度的原代心肌細(xì)胞是實(shí)驗(yàn)成功的基礎(chǔ)。但由于人類心肌細(xì)胞只有在特殊情況下才能少量增殖[3]，并且人類心肌細(xì)胞獲取困難，不能滿足實(shí)驗(yàn)需要。目前原代心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以SD乳鼠心肌細(xì)胞為主。近年來(lái)SD乳鼠心肌細(xì)胞的提取技術(shù)不斷優(yōu)化。隨著研究的不斷深入與進(jìn)展，C57BL/6J小鼠因和人類基因相近，從而更多的被科研使用。但相對(duì)于C5BL/6J小鼠動(dòng)物模型的廣泛使用，因C57BL/6J小鼠乳鼠因體型較小，乳鼠心肌細(xì)胞獲得量低，C57BL/6J乳鼠心肌細(xì)胞未被廣泛使用。因課題需要C57BL/6J乳鼠心肌細(xì)胞，在多次試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞提取進(jìn)行改良，獲得滿意效果。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生C57BL/6J乳鼠(出生1～3 d，最好在24 h內(nèi))。由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司購(gòu)買(許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010)，北京維通利華動(dòng)物技術(shù)有限公司鑒定(實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)SYXK(京)2017-0015)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)倫理 本實(shí)驗(yàn)研究嚴(yán)格遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，并獲得內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院動(dòng)物試驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備 胰蛋白酶(含EDTA)、DMEM低糖培養(yǎng)基、Hanks平衡鹽溶液(不含鈣鎂)、5-溴-2-脫氧尿核苷(Brdu)、BSA 、PBS緩沖液、tritonX-100均購(gòu)自英國(guó)sigma公司；膠原蛋白酶Ⅱ型、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)gibco公司；Anti-heavy chain cardiac Myosion抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司(ab50967)；cy3標(biāo)記山羊抗小鼠二抗購(gòu)自北京碧云天生物科技有限公司；DAPI購(gòu)自北京中杉金橋公司；驢血清、Tween-20、4 %多聚甲醛均購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)公司；青鏈霉素購(gòu)自美國(guó)scien cell公司；超凈臺(tái)、細(xì)胞培養(yǎng)箱、離心機(jī)均購(gòu)自美國(guó)thermo公司，muse細(xì)胞技術(shù)儀(德國(guó)MercK)，倒置熒光顯微鏡(德國(guó)leica公司)，200目篩網(wǎng)，眼科直剪、彎剪各兩套，眼科直鑷、彎鑷各2套，濾器，注射器，燒瓶50 mL(帶塞，可封閉)，自制攪拌子(除去用大頭針針尖，兩邊用小膠管套住，系緊)，500 mL燒杯，磁力攪拌水浴鍋(德國(guó)IKA公司)。

1.2方法

1.2.1消化酶的配置 胰蛋白酶和II型膠原蛋白酶用Hanks(不含鈣鎂)配置，稀釋成0.06 %的胰蛋白酶及0.04 %膠原蛋白酶。

1.2.2心肌細(xì)胞的提取與純化 取出生在1～3 d(最好出生在在24 h內(nèi))的C57BL/6J乳鼠20只，戴手套，取一只放入盛有75 %酒精容器內(nèi)，約10秒鐘，左手捏住乳鼠的背部，右手在乳鼠劍突下剪開皮膚，輕輕用剪刀挑開至小鼠頸部，左手輕微擠壓，小鼠心臟便突出胸腔，右手用鑷子快速夾取心臟，放入預(yù)冷的不含鈣鎂的Hanks溶液中，重復(fù)此過(guò)程直至處理完所有小鼠(最好1 h內(nèi)處理完20只小鼠)。將小鼠尸體移出。更換手套，用另一套直鑷和彎鑷進(jìn)行操作。只保留呈橢圓形的心尖部分，剔除心房，同時(shí)再次擠壓心臟，擠出心腔內(nèi)血液，放入新的預(yù)冷的不含鈣鎂的Hanks溶液中。將所有心臟修剪完畢后，放入1.5 mLEP管內(nèi)，用剪刀剪碎心臟，剪成肉末狀。將心臟移入50 mL燒瓶中(內(nèi)有自制攪拌子)封閉燒瓶，加入10 mL 0.06 %胰蛋白酶，放入盛有水預(yù)溫在37 ℃的磁力攪拌器上，將轉(zhuǎn)速控制在30～40 r/min，消化10 min。將上清液去除。將10 mL 0.04 %Ⅱ型膠原蛋白酶放入燒杯，繼續(xù)放入37 ℃的水中，將轉(zhuǎn)速控制在30～40 r/min，消化8 min，加入10 mL 10 %胎牛血清的DMEM低糖完全培養(yǎng)基，中和Ⅱ型膠原蛋白酶。吸取上清液，放入50 mL離心管。加入10 mL 0.04 %Ⅱ型膠原蛋白酶繼續(xù)消化，重復(fù)此步驟，約5～7次，可將所有心臟組織消化完畢。將所有上清液經(jīng)過(guò)200目濾網(wǎng)，清除未被消化的心臟組織，收集過(guò)濾出的液體于新的50 mL離心管中。將離心管放入離心機(jī)內(nèi)1 000 r/min,離心5 min，除去上清液。用6 mL 10 %胎牛血清的低糖DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，重懸后放入直徑10 cm的培養(yǎng)皿中。放入37 ℃，5 %CO2恒溫的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，靜置90 min后，取出培養(yǎng)皿，在無(wú)菌操作臺(tái)上操作，吸取培養(yǎng)基放入50 mL離心管內(nèi)。用移液器輕輕吹打混勻，吸取20 μL加入0.4 %臺(tái)盼藍(lán)溶液20 μL，在顯微鏡下測(cè)定細(xì)胞成活率(死亡細(xì)胞被染成藍(lán)色，有活力的細(xì)胞不被染色)。每個(gè)視野選取100個(gè)細(xì)胞，未被染色的細(xì)胞數(shù)，即為細(xì)胞存活率。每次數(shù)4個(gè)視野。吸取100 μL細(xì)胞懸液放入100 μL完全培養(yǎng)基中，混勻，在muse計(jì)數(shù)儀上計(jì)數(shù)，得出每毫升細(xì)胞數(shù)，乘以目前所獲懸浮細(xì)胞液體積，就是此次所得細(xì)胞數(shù)。根據(jù)所獲細(xì)胞量及要做實(shí)驗(yàn)的目的，調(diào)整所需細(xì)胞量。遵循以下規(guī)則，觀察細(xì)胞形態(tài)(4～5)×105/mL,提取蛋白或提取RNA等操作細(xì)胞量需控制在1×106/mL，加入0.1 mmol/L Brdu，放入培養(yǎng)板中培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)放置24 h后給予換液，(切記在24 h內(nèi)過(guò)度晃動(dòng)，切記觀察次數(shù)過(guò)頻繁，影響細(xì)胞貼壁，使細(xì)胞貼壁不勻，造成細(xì)胞聚集)，清除沒有貼壁及活力較差的細(xì)胞，同時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)。每隔2 d換液1次。

1.2.3細(xì)胞形態(tài)觀察 分別于24 h，48 h，72 h，第5 d觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照。

1.2.4心肌細(xì)胞純度鑒定 培養(yǎng)第3 d行細(xì)胞純度鑒定，用免疫熒光法鑒定心肌細(xì)胞。具體方法如下：配置濃度為1 %BSA及的PBST,一抗為Anti-heavy chain cardiac Myosion抗體，二抗為cy3標(biāo)記山羊抗小鼠抗體(帶有紅色熒光)。用PBS沖洗細(xì)胞2次。4 %多聚甲醛常溫下固定心肌細(xì)胞10 min后，用PBS清洗細(xì)胞2次，每次5 min，加入0.25 %tritonX-100室溫下透化細(xì)胞10 min，10 %驢血清封閉30 min，加入濃度為1 %BSA的PBST，稀釋的一抗(1∶200)，常溫下?lián)u床1 h，再次用PBS清洗細(xì)胞，避光加入1 %BSA的PBST稀釋的cy3標(biāo)記山羊抗小鼠二抗(1∶500)，孵育1 h，加入DAPI，倒置熒光顯微鏡下計(jì)算心肌細(xì)胞純度，每個(gè)視野選取100個(gè)細(xì)胞，被染色的細(xì)胞數(shù)量，即為此視野心肌細(xì)胞數(shù)，本實(shí)驗(yàn)共選取5個(gè)視野。

1.2.5細(xì)胞活力測(cè)定 細(xì)胞活力可以直觀的從細(xì)胞搏動(dòng)狀態(tài)反應(yīng)出來(lái)，自細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，每天10：00，14：00，18：00，22：00觀察第3～9 d細(xì)胞搏動(dòng)情況。

2 結(jié)果

2.1心肌細(xì)胞存活率 經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)算細(xì)胞成活率平均值在95.5 %。見表1。

表1 臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定心肌細(xì)胞成活率

2.2細(xì)胞數(shù)量測(cè)定 經(jīng)細(xì)胞技術(shù)儀檢測(cè)，本次共獲取心肌細(xì)胞9.32×106個(gè)。

2.3細(xì)胞形態(tài)及搏動(dòng)情況 心肌細(xì)胞2～4 h開始貼壁24 h大部分貼壁，剛貼壁細(xì)胞呈類圓形，貼壁后逐漸伸展伸出偽足，少數(shù)可出現(xiàn)博動(dòng)，細(xì)胞折光性能好，呈星型或梭型。72 h后細(xì)胞交織成網(wǎng)，相連組成合胞體，規(guī)律性搏動(dòng)。第5 d后細(xì)胞密集，胞體明顯增大，形成細(xì)胞簇，搏動(dòng)次數(shù)更快。細(xì)胞從第3 d開始細(xì)胞搏動(dòng)一致，在細(xì)胞培養(yǎng)2周內(nèi)，搏動(dòng)次數(shù)在50～130次/分，2周后細(xì)胞搏動(dòng)次數(shù)較低，有時(shí)已停止搏動(dòng)。見圖1。

2.4心肌細(xì)胞純度鑒定 倒置熒光顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞。紅色為熒光標(biāo)記的Anti-heavy chain cardiac Myosion抗體，藍(lán)色為細(xì)胞核，經(jīng)測(cè)定純度平均可達(dá)94 %。見圖2，表2。

表2 心肌細(xì)胞純度鑒定結(jié)果

2.5心肌細(xì)胞活力 自第3 d開始細(xì)胞搏動(dòng)次數(shù)逐漸增高，與第3 d細(xì)胞活力相比與細(xì)胞培養(yǎng)4～9 d相比，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。第6 d與第7 d活力相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第8 d與第7 d活力相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3，圖3。

表3 心肌細(xì)胞活力測(cè)定(n=4,次/分)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在原有乳鼠心肌細(xì)胞提取基礎(chǔ)上，對(duì)C57BL/6J乳鼠進(jìn)行心肌細(xì)胞提取，并對(duì)原有心肌細(xì)胞提取技術(shù)進(jìn)行改良。傳統(tǒng)方法只使用胰蛋白酶，胰蛋白酶活性強(qiáng)，雖能也可以消化心臟組織產(chǎn)生心肌細(xì)胞，但細(xì)胞產(chǎn)量較低，心肌細(xì)胞破壞嚴(yán)重。Ⅱ膠原蛋白酶對(duì)心臟親和力強(qiáng)，使心肌組織疏松，便于心肌細(xì)胞的分離。目前均采用胰蛋白酶聯(lián)合Ⅱ型膠原蛋白酶的消化方法，消化酶用不含鈣鎂的溶液配置，可以保證消化酶的消化強(qiáng)度，不破壞消化酶酶的活性，使之能夠更好的消化組織[4-6]。本實(shí)驗(yàn)降低胰酶濃度及膠原蛋白濃度，在保證消化酶活性的同時(shí)，盡量減少消化酶對(duì)心肌細(xì)胞的損害，促進(jìn)心肌細(xì)胞的產(chǎn)量。為保證心肌細(xì)胞的純度以及避免污染，建議在乳鼠劍突下剪開胸腔，避免剪開腹腔。加入自制攪拌子[5]，更夠加速消化酶和心臟組織充分混合，繼而能夠更好的消化。同時(shí)大針較細(xì)，轉(zhuǎn)速度較低，避免旋轉(zhuǎn)對(duì)心肌細(xì)胞造成損害，最大程度的保護(hù)心肌細(xì)胞，促進(jìn)心肌細(xì)胞的產(chǎn)出。成纖維細(xì)胞在2h內(nèi)貼壁，心肌細(xì)胞2～4h開始貼壁。因此采用差速貼壁方法，既往差速貼壁時(shí)間60～120 min不等[4-10]，有研究曾分別給與差速貼壁60 min、90 min、120 min。結(jié)果60 min細(xì)胞數(shù)相比較多，但細(xì)胞純度較90 min、120 min純度較低。120 min純度較90 min無(wú)差別，但細(xì)胞數(shù)目少，綜上選用90 min差速貼壁效果較好。成纖維細(xì)胞可以增殖，因此用Brdu抑制成纖維細(xì)胞DNA的合成，從而抑制成纖維細(xì)胞增殖，保證心肌細(xì)胞純度。所有試驗(yàn)Brdu濃度均采用0.1 mmol/L[4-10]，本實(shí)驗(yàn)也采用了此濃度。心肌細(xì)胞內(nèi)包含肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白，肌鈣蛋白。故可以用三種抗體中的任意一種抗體進(jìn)行鑒定，本文采用抗肌球蛋白抗體給予鑒定。為探討心肌細(xì)胞的干預(yù)時(shí)間，對(duì)心肌細(xì)胞活性給與測(cè)定，并進(jìn)行分析。通過(guò)測(cè)定心肌細(xì)胞在4～7 d，活性逐漸升高，第7 d活性最高，7 d后活性逐漸降低，因此建議心肌細(xì)胞干預(yù)實(shí)驗(yàn)在4～7 d內(nèi)進(jìn)行。

總之本研究改良了現(xiàn)存的乳鼠心肌提取方法，采用本方法使C57BL/6J乳鼠心肌細(xì)胞活性好，產(chǎn)量高，純度高，并且給予確認(rèn)最佳心肌細(xì)胞干預(yù)時(shí)間便于進(jìn)一步進(jìn)行心血管疾病研究。