無定形磷酸鈣在不同介質(zhì)中的穩(wěn)定性研究

樊鴻星，吳 剛

(內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學與法醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 包頭 014040)

骨和牙的主要無機成分為磷酸鈣鹽，其成分和結(jié)構(gòu)接近羥基磷灰石[Hydroxyapatite，HAP，Ca10(PO4)6(OH)2]，而無定形磷酸鈣[Amorphous calcium phosphate，ACP，Ca3(PO4)2]被認為是骨礦化過程的前驅(qū)體，無定形磷酸鈣最早是人們在用濕法合成羥基磷灰石時發(fā)現(xiàn)[1]。ACP在水相中難以穩(wěn)定存在，過飽和的鈣磷溶液互相混合時，ACP是最先產(chǎn)生的固相，隨后逐漸向熱力學穩(wěn)定的HAP轉(zhuǎn)變。ACP在潮濕環(huán)境中能迅速轉(zhuǎn)化為HAP，其壽命長短與反應系統(tǒng)的pH值、溶液離子強度、溫度、外加離子及生物大分子等密切相關(guān)。隨著現(xiàn)代科學不斷發(fā)展，多項研究已證明ACP在各種生物體中廣泛存在。在正常生理狀態(tài)下，存在于生物介質(zhì)如血液、細胞外液和細胞培養(yǎng)基中的鈣離子和磷酸根離子濃度已經(jīng)處于過飽和狀態(tài)，其離子積遠大于溶度積，有較強的自發(fā)生成磷酸鈣鹽的趨勢。但是生物介質(zhì)中并未產(chǎn)生磷酸鈣鹽的沉積，這是因為在血清中存在一些抑制磷酸鈣鹽沉淀生成的因子，如胎球蛋白A、基質(zhì)Gla蛋白、骨保護素以及焦磷酸鹽等，它們與磷酸鈣鹽微粒相結(jié)合，阻止微粒形成、長大和聚集，在生物介質(zhì)中的化學行為不同于單純的水溶液狀態(tài)[2-5]。在脊椎動物骨骼和牙齒的礦化過程中發(fā)現(xiàn)存在著大量ACP[6]。ACP的合成方法有多種，大致分為濕法和干法兩大類。濕法是在純水系統(tǒng)、非水系統(tǒng)或者溶劑-水的二元系統(tǒng)中，將鈣磷溶液混合制備。干法合成是在低溫下離子濺射合成ACP或?qū)⑷廴跔顟B(tài)的磷酸鈣材料(CaPs)迅速猝滅。本研究采用濕法制備，探究ACP在純水和大鼠血清兩種不同系統(tǒng)中的差異。

1 對象與方法

1.1實驗動物 無特定病原體(Specific pathogen free，SPF)級健康SD雄性大鼠20只，體質(zhì)量160～180 g。北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物質(zhì)量合格證明書編號：SCXK(京)2016-0006。

1.2試劑和儀器 二水氯化鈣(CaCl2·2H2O，美國Sigma公司)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4，美國Sigma公司)、氫氧化鈉(NaOH，北京化工廠)、鹽酸(HCl分析純，北京化工廠)、無水乙醚(Diethyl ether，北京市通廣精細化工公司)、75 %乙醇消毒液(Ethanol 75 %，山東利爾康消毒科技有限公司)。電子天平(AL104，瑞士梅特勒-托利多公司)、超純水儀(Aquaprince，重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司)、水浴恒溫槽(SDC-6，寧波新芝生物科技股份有限公司)、Seven多功能測定儀(S470-K，瑞士梅特勒-托利多公司)、高速離心機(HC-3018，安徽中科中佳科學儀器有限公司)、快速混勻器-MX-F，大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司。同步輻射XANES裝置(中科院北京高能物理研究所)。

1.3實驗方法

1.3.1制備大鼠血清 使大鼠吸入適量乙醚進入麻醉狀態(tài)。剪掉大鼠胡須，將眼眶周圍擦拭干凈以減少溶血風險。左手抓住大鼠頸部皮膚，輕壓在實驗臺上，取側(cè)臥位，且左手食指盡量將大鼠眼周皮膚往頸后壓，使眼球突出。右手使用已消毒的眼科彎鑷迅速夾去眼球，將大鼠倒立，用準備好的5 mL離心管接住流出的血液。室溫靜置15～30 min后，1 500 g轉(zhuǎn)速離心15 min。取出后觀察血清顏色，棄去溶血樣本，取淡黃色上清液即為實驗所需血清樣本。

1.3.2監(jiān)測水溶液Ca2+濃度和pH值變化 在50 mL燒杯中加入CaCl2溶液(10 mmol/L)10 mL，水浴恒溫25 ℃，再加入等體積的NaH2PO4溶液(10 mmol/L)，開始攪拌，并且使混合溶液的初始pH值在7.30～7.35之間，連續(xù)1 h監(jiān)測Ca2+濃度和pH值的變化并做好記錄。

1.3.3監(jiān)測大鼠血清Ca2+濃度和pH值變化 在5 mL離心管中加入CaCl2溶液(20 mmol/L)2.5 mL，再加入等體積的NaH2PO4溶液(20 mmol/L)，快速混勻，5 000 g轉(zhuǎn)速離心2 min，快速棄去上清液，將沉淀物加入水浴恒溫25 ℃的10 mL等體積混合的大鼠血清中，混勻并且調(diào)整pH初始值在7.30～7.35之間，連續(xù)1 h監(jiān)測Ca2+濃度和pH值的變化并做好記錄。

1.3.4ACP轉(zhuǎn)變?yōu)镠AP 將制備的ACP添加到血清中混勻，取樣。使用同步輻射裝置測近邊光譜。待恒溫3 h后，再取樣，同樣測其近邊光譜?？疾煅逯蠥CP的存在狀態(tài)。

2 結(jié)果

2.1水溶液檢測情況 (1)Ca2+濃度的變化：在反應溫度恒定，初始pH值一致的條件下，可以看到水溶液中Ca2+濃度短時間快速降低，然后經(jīng)過15 min的平臺區(qū)，稱為誘導期；隨后快速降低，稱為突降期；最后進入一段穩(wěn)定期，如圖1所示。(2)pH的變化：在水溶液中，pH值同樣經(jīng)過誘導期、突降期和穩(wěn)定期，如圖2所示。

2.2血清中CAP與HAP的分析 同步輻射測定光譜結(jié)果顯示：在大鼠血清添加現(xiàn)合成的無定形磷酸鈣(ACP)的吸收曲線與添加羥基磷灰石(HAP)的吸收曲線，如圖3所示。恒溫3 h后，吸收曲線幾乎完全重合，如圖4所示。由此證明ACP已經(jīng)完全轉(zhuǎn)化為HAP，說明在生物介質(zhì)中，經(jīng)過足夠長的時間后，ACP也將轉(zhuǎn)化成更穩(wěn)定的HAP。

2.3血清的檢測情況 (1)Ca2+濃度的變化:在血清中，Ca2+濃度持續(xù)緩慢上升一段時間，最后逐漸穩(wěn)定，如圖5所示。(2)pH的變化:在血清中，pH值幾乎是呈持續(xù)增長趨勢，但是在后期漲幅逐漸趨于穩(wěn)定,如圖6所示。

3 討論

本研究結(jié)果顯示,水溶液中Ca2+濃度開始時有短暫的降低(圖1)，主要因為初始加入NaH2PO4溶液時，反應體系內(nèi)短時間發(fā)生的反應并未達到穩(wěn)定，所以在前1～2 min內(nèi)，Ca2+濃度會出現(xiàn)明顯下降。這一過程中H2PO4-釋放一個H+變?yōu)镠PO42-，HPO42-進一步與Ca2+結(jié)合形成CaHPO4，因此Ca2+出現(xiàn)一個明顯的下降過程。在此過程中Ca2+與HPO42-的濃度達到CaHPO4的溶度積，首先形成CaHPO4，pH值隨著H+的釋放不斷下降。當Ca2+與HPO42-全部轉(zhuǎn)化為CaHPO4時，Ca2+濃度處于第一個平臺區(qū)。隨著HPO42-進一步解離一個H+，HPO42-轉(zhuǎn)化為PO43-，PO43-與Ca2+形成Ca3(PO4)2，Ca2+濃度再次下降，并且pH值隨著H+的進一步釋放，有明顯的下降過程(圖2)，H2PO4-轉(zhuǎn)化為PO43-，釋放兩個H+。圖1和圖2對比可知，在同一種反應系統(tǒng)中，Ca2+濃度和pH值的變化趨勢一致。Ca2+完全形成Ca3(PO4)2后Ca2+濃度下降不明顯，并逐步趨于穩(wěn)定，pH值也將趨于穩(wěn)定，進入第二個平臺區(qū)。但Ca3(PO4)2(ACP)無定形沉淀不穩(wěn)定，逐步會演變?yōu)镃a10(PO4)6(OH)2(HAP)，Ca/P比值將發(fā)生變化，由4.5/3演變?yōu)?/3，Ca2+濃度下降，但過程極其緩慢，完全轉(zhuǎn)化為Ca10(PO4)6(OH)2后，Ca2+濃度趨于穩(wěn)定。在純水系統(tǒng)中，誘導期就是形成ACP的過程，突降期是ACP轉(zhuǎn)變?yōu)镠AP的過程，最終形成穩(wěn)定的HAP。從突降期開始到最終變化穩(wěn)定大約需要5～7 min。Ca3(PO4)2(ACP)無定形沉淀不穩(wěn)定，逐步會演變?yōu)镃a10(PO4)6(OH)2(HAP)的相關(guān)研究已經(jīng)有較多文獻報道。

為了進一步明確在血清體系中ACP是否也最終轉(zhuǎn)變?yōu)镠AP，本研究采用同步輻射裝置測其X-射線吸收近邊結(jié)構(gòu)，觀察在血清體系中ACP是否轉(zhuǎn)變?yōu)镠AP。如圖3和圖4所示，在大鼠血清中分別添加ACP和HAP后，立刻利用同步輻射裝置進行光譜測定，ACP和HAP光譜曲線明顯不同，血清添加ACP后檢測到了ACP的特征峰(*Energy4047處)(圖3)。在恒溫放置3 h后，ACP光譜曲線與HAP光譜曲線幾乎完全重合，ACP特征峰消失，說明在大鼠血清體系中Ca3(PO4)2(ACP)無定形沉淀也不穩(wěn)定，在一定時間下，也將逐步演變?yōu)镃a10(PO4)6(OH)2(HAP)。

在大鼠血清系統(tǒng)的研究中，加入ACP后會發(fā)生沉淀的解離。隨著沉淀的解離，Ca2+濃度逐漸升高(圖5)，達到解離平衡時Ca2+濃度穩(wěn)定，處于平臺區(qū)。解離出來的PO43-結(jié)合H+轉(zhuǎn)化為HPO42-，H+濃度逐步下降，pH值逐步升高，達到沉淀解離平衡時pH值也逐步穩(wěn)定，形成PO43-/HPO42-緩沖體系。從加入ACP到其變化為HAP基本穩(wěn)定時大約需要37 min，由此可以證明在血清作為介質(zhì)時，ACP轉(zhuǎn)變?yōu)镠AP需要的時間更長，ACP的穩(wěn)定性比在純水系統(tǒng)中更高，因為血清胎球蛋白A和白蛋白具有抑制顆粒物產(chǎn)生和增大的作用[7,3]。從圖5中可以發(fā)現(xiàn)隨著時間的變化，Ca2+濃度逐漸增加，由于ACP在血清中被稀釋，聚集的磷酸鈣簇分散開，才會使其發(fā)生解離，鈣離子逐漸增多。最后趨于穩(wěn)定是由于實驗系統(tǒng)中的血清蛋白含量有限所致，且血清蛋白具有一定抑制作用。由圖5和圖6對比可知在生物介質(zhì)中，Ca2+濃度和pH值的變化趨勢一致。大鼠血清系統(tǒng)中關(guān)于血清蛋白在磷酸鈣鹽結(jié)晶過程中作用的相關(guān)研究較少，目前認為血清蛋白對磷酸鈣鹽的生成和聚集有抑制作用[8-10]。

無定形磷酸鈣(ACP)是在結(jié)晶過程初期出現(xiàn)的一種亞穩(wěn)態(tài)前驅(qū)相，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都取決于構(gòu)成它的離子簇。由于離子簇尺寸小、化學性質(zhì)不穩(wěn)定，在檢測方面受到許多限制。近幾年，離子簇的研究方法大多數(shù)以原位檢測為主，這樣可以跟蹤檢測溶液中真實發(fā)生的化學變化，同時不會對反應造成影響，能夠直觀、實時的進行動態(tài)觀察[11-12]。本研究采用同步輻射裝置測其X-射線吸收近邊結(jié)構(gòu)，它是吸收光譜的一種類型，反映了吸收邊的邊前區(qū)(-20 ev)至吸收邊后50 ev部分的吸收特性，它是由激發(fā)光電子受周圍原子的多重散射造成的，不僅能反映中心吸收原子的配位化學環(huán)境，還能反映低能位電子態(tài)的結(jié)構(gòu)。經(jīng)過近20年的發(fā)展，目前已獲得了廣泛應用。