腸膜明串珠菌乳糖及半乳糖代謝差異性研究

安東妮，張 蘭，張春雪，譚冬梅，吳 怡，劉小鳴*，趙建新，張 灝，陳 衛(wèi)

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

腸膜明串珠菌（Leuconstoc mesenteroides）是乳酸菌明串珠菌屬的重要菌種之一。腸膜明串珠菌有4 個(gè)亞種[1]，其中作為可食用菌種之一的腸膜亞種具有產(chǎn)酸快、風(fēng)味佳、抑菌性強(qiáng)等優(yōu)良的發(fā)酵特性[2-6]，是乳制品混菌發(fā)酵體系中常見(jiàn)的組成菌株之一[7-11]，其以雙乙酰、醋酸和乙醇為主的代謝產(chǎn)物有助于改善風(fēng)味[12-14]，其胞外多糖也有利于提高發(fā)酵乳制品品質(zhì)[15]。

乳糖是牛乳中的主要碳水化合物，半乳糖是乳糖分子的組成單元，乳酸菌的乳糖及半乳糖代謝能力是其在發(fā)酵乳制品中應(yīng)用的關(guān)鍵影響因素之一[16]。目前，對(duì)乳糖代謝的研究表明，乳酸菌中存在2 條乳糖代謝通路[17]：一條是通過(guò)磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（phosphotransferase systems，PTS）攝入乳糖，經(jīng)塔格糖-6-磷酸（tagatose-6-phosphate，T6P）途徑進(jìn)行轉(zhuǎn)化代謝；另一條是通過(guò)乳糖透性酶攝入乳糖，經(jīng)Leloir途徑進(jìn)行水解代謝，且上述代謝途徑已可用基因編碼進(jìn)行注釋[18]。

腸膜明串珠菌是專(zhuān)一性的異型發(fā)酵乳酸菌[19]，借助滲透酶吸收碳水化合物，在對(duì)底物不加修飾的情況下，將碳源從細(xì)胞外轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)。在β-半乳糖苷酶的作用下，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的乳糖被降解為葡萄糖和β-D-半乳糖，葡萄糖進(jìn)入磷酸戊糖途徑，被轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖并進(jìn)行降解，形成6-磷酸果糖，在磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的作用下進(jìn)一步分解為3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮；3-磷酸甘油醛進(jìn)入糖酵解途徑被轉(zhuǎn)化為丙酮酸，丙酮酸則在D-乳酸脫氫酶的作用下被轉(zhuǎn)化為D-乳酸[17]。腸膜明串珠菌還可以通過(guò)Lelior途徑代謝半乳糖，即半乳糖在半乳糖變旋酶、半乳糖激酶、UDP-半乳糖差向異構(gòu)酶等酶的作用下，經(jīng)過(guò)一系列生化反應(yīng)合成胞外多糖。

腸膜明串珠菌不僅可以利用乳糖進(jìn)行發(fā)酵，還可以利用蔗糖等多種碳水化合物進(jìn)行發(fā)酵。鄢明輝[20]通過(guò)蔗糖利用率評(píng)價(jià)腸膜明串珠菌BD3749生長(zhǎng)狀況，結(jié)果表明，腸膜明串珠菌在含蔗糖的番茄汁中可以生長(zhǎng)產(chǎn)酸，且能大量合成胞外多糖。于艷婷等[21]利用腸膜明串珠菌進(jìn)行糙米乳乳酸發(fā)酵，研究其生長(zhǎng)特性，結(jié)果表明，該菌株能利用糙米乳中的糖類(lèi)發(fā)酵產(chǎn)乳酸，且確定了產(chǎn)乳酸的最佳發(fā)酵條件為接菌量5%、發(fā)酵溫度30 ℃、培養(yǎng)時(shí)間22 h。旭日花等[22]對(duì)分離自通遼市牧民家庭乳樣的61 株乳酸菌進(jìn)行研究，從中篩選出2 株腸膜明串珠菌葡聚糖亞種發(fā)酵糖的能力較強(qiáng)。

本研究選取8 株腸膜明串珠菌，測(cè)定它們?cè)谝匀樘?、半乳糖、葡萄糖為單一碳源的化學(xué)限定培養(yǎng)基（chemically de fined medium，CDM）和脫脂乳中的生長(zhǎng)及產(chǎn)酸情況，并探究不同腸膜明串珠菌在乳糖及半乳糖代謝能力方面的差異性，旨在為腸膜明串珠菌在發(fā)酵乳制品中的應(yīng)用提供一定的理論與應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、無(wú)水葡萄糖、檸檬酸氫二銨、吐溫-80、CH3COONa、MgSO4·7H2O、MnSO4·3H2O、K2HPO4·3H2O、瓊脂粉、脫脂乳粉、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸、煙酸、泛酸、吡哆醛、核黃素、對(duì)氨基苯甲酸、葉酸、氰鈷胺、生物素、硫胺素、腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、肌苷、黃嘌呤、乳清酸、尿嘧啶、胸腺嘧啶（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

實(shí)驗(yàn)菌株信息如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株信息Table 1 Information on strains used in this study

分別測(cè)定19 株腸膜明串珠菌在CDM-乳糖和CDM-半乳糖培養(yǎng)基2 個(gè)環(huán)境下的OD600nm和pH值變化情況，并根據(jù)培養(yǎng)12 h后OD600nm的大小判別其對(duì)乳糖及半乳糖利用能力的強(qiáng)弱（OD600nm越大，表示對(duì)乳糖或半乳糖的利用能力越強(qiáng)），分為4 個(gè)類(lèi)別，分類(lèi)情況見(jiàn)表1。A、B、C三類(lèi)中分別選取生長(zhǎng)特性最為突出的2 株菌作為實(shí)驗(yàn)菌株，即LM1、LM2、LM3、LM4、LM5、LM8；D類(lèi)考慮到生長(zhǎng)情況太弱不利于指標(biāo)檢測(cè)及后續(xù)研究，故選擇對(duì)乳糖和半乳糖利用情況較差的2 株菌作為實(shí)驗(yàn)菌株，即LM6、LM7，共選擇8 株腸膜明串珠菌作為實(shí)驗(yàn)菌株。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 島津儀器（蘇州）有限公司；3020酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；ST3100 pH計(jì) 奧豪斯儀器（常州）有限公司；MK-20干式恒溫器 杭州奧盛儀器有限公司；HWS-150恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；GR60DA立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋 致微（廈門(mén)）儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

MRS培養(yǎng)基：參照Wu Qinglong等[17]的配方配制；CDM培養(yǎng)基：參照文獻(xiàn)[23-25]配方配制。CDM培養(yǎng)基完全溶解后將pH值調(diào)至6.5左右，經(jīng)過(guò)濾滅菌后保存于4 ℃?zhèn)溆茫渌囵B(yǎng)基在使用前均于115 ℃中滅菌20 min，脫脂乳使用前于105 ℃滅菌10 min。

1.3.2 菌株活化

實(shí)驗(yàn)前菌株需在MRS培養(yǎng)基中活化3 代，第1代從保菌管中蘸取菌液，涂布于MRS固體平板上，劃線分離，30 ℃培養(yǎng)24 h；第2代挑取單菌落至MRS液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h；第3代按體積分?jǐn)?shù)2%接種于MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)12 h。

1.3.3 菌株在CDM中的生長(zhǎng)特性測(cè)定

將活化后的菌液按體積分?jǐn)?shù)2%分別接種于CDM-乳糖、CDM-半乳糖、CDM-葡萄糖、CDM-無(wú)糖液體培養(yǎng)基中，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 h取樣測(cè)定pH值和OD600nm，測(cè)定0、2、4、6、8、10、12 h菌株的生長(zhǎng)及產(chǎn)酸情況。每隔6 h取樣測(cè)定活菌數(shù)，測(cè)定0、6、12 h的活菌數(shù)變化。

1.3.4 菌株在脫脂乳中的生長(zhǎng)特性測(cè)定

將活化后的菌株按體積分?jǐn)?shù)2%分別接種于11 g/100 mL脫脂乳中，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 h取樣測(cè)定pH值及活菌數(shù)，測(cè)定0、2、4、6、8、10、12、14、24 h菌株生長(zhǎng)、產(chǎn)酸及活菌數(shù)變化情況。

1.3.5 各菌株與乳糖、半乳糖代謝相關(guān)基因的差異性分析

在KEGG網(wǎng)站查詢(xún)腸膜明串珠菌的乳糖及半乳糖不同代謝途徑相關(guān)基因數(shù)量并進(jìn)行差異性分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各實(shí)驗(yàn)均設(shè)2 組平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株在不同碳源的CDM培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特性

2.1.1 菌株在CDM-乳糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特性

由圖2～4可知，實(shí)驗(yàn)菌株在以乳糖為單一碳源的CDM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況可分為2 類(lèi)：一類(lèi)能夠穩(wěn)定生長(zhǎng)（LM1、LM2、LM4、LM8），培養(yǎng)12 h后其OD600nm均大于0.500，pH值均降低至5以下，活菌數(shù)差異較大；一類(lèi)幾乎不利用乳糖產(chǎn)酸，僅能維持基本生長(zhǎng)，培養(yǎng)0～12 h的OD600nm增長(zhǎng)均不超過(guò)0.100，pH值也只下降了0.1～0.2。其中，菌株LM1培養(yǎng)12 h后的OD600nm高達(dá)1.240，pH值降至4.44；菌株LM8培養(yǎng)12 h后的OD600nm高達(dá)1.132，pH值降至4.71；發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，菌株LM1、LM2和LM4的活菌數(shù)超過(guò)8 （lg（CFU/mL）），菌株LM8的活菌數(shù)低于8 （lg（CFU/mL））。說(shuō)明菌株LM1、LM2和LM4可以很好地利用乳糖生長(zhǎng)繁殖，且在發(fā)酵12 h后未進(jìn)入衰退期，菌株LM8可以很好地利用乳糖產(chǎn)酸，發(fā)酵12 h后可能已經(jīng)進(jìn)入衰退期。由此可知，不同腸膜明串珠菌在以乳糖為單一碳源環(huán)境中的生長(zhǎng)及產(chǎn)酸情況存在很大差異。

2.1.2 菌株在CDM-半乳糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特性

由圖5～7可知，實(shí)驗(yàn)菌株在以半乳糖為單一碳源的CDM培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況仍可大致分為2 類(lèi)。以發(fā)酵終點(diǎn)pH值是否降至6.0以下為界，一類(lèi)能夠穩(wěn)定生長(zhǎng)（LM2、LM3、LM5、LM8），至發(fā)酵終點(diǎn)仍未進(jìn)入穩(wěn)定期，其中，菌株LM2生長(zhǎng)情況最佳，培養(yǎng)12 h的OD600nm達(dá)0.508，pH值降至5.33；菌株LM5培養(yǎng)12 h的OD600nm為0.478，pH值降至5.56；菌株LM8培養(yǎng)12 h的OD600nm為0.478，pH值降至5.54；菌株LM3的生長(zhǎng)情況稍次于上述3 株菌，培養(yǎng)12 h后OD600nm為0.299，pH值降至5.85。另一類(lèi)菌株幾乎無(wú)法利用半乳糖（LM1、LM4、LM6、LM7），僅能維持基本生長(zhǎng)，培養(yǎng)8 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，培養(yǎng)12 h后OD600nm的增長(zhǎng)不超過(guò)0.200，pH值均高于6.0，活菌數(shù)差值小于1 （lg（CFU/mL））。半乳糖環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)菌與乳糖環(huán)境下的優(yōu)勢(shì)菌相比，生長(zhǎng)情況較弱，發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)其OD600nm均小于0.600，且pH值均未降至5.0之下。

2.1.3 菌株在CDM-葡萄糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特性

由圖8～10可知，所有實(shí)驗(yàn)菌株在以葡萄糖為碳源的CDM培養(yǎng)基中均可生長(zhǎng)，但是pH值及OD600nm的變化幅度不同：培養(yǎng)12 h后，菌株LM2 OD600nm最小，為0.853，菌株LM7 OD600nm最大，達(dá)到1.864，遠(yuǎn)高于其他菌株；菌株的產(chǎn)酸能力也有顯著提升，發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)pH值均降低至5以下，菌株的產(chǎn)酸能力也有差異，其中菌株LM7產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，培養(yǎng)12 h后pH值下降至4.17，菌株LM4產(chǎn)酸能力最弱，培養(yǎng)12 h后pH值下降至4.67；菌株培養(yǎng)12 h后的活菌數(shù)均超過(guò)8 （lg（CFU/mL）），其中生長(zhǎng)活力最強(qiáng)的菌株LM7超過(guò)9 （lg（CFU/mL）），明顯強(qiáng)于在乳糖、半乳糖環(huán)境中的生長(zhǎng)情況。表明菌株LM7生長(zhǎng)量較大、活力較強(qiáng)。

2.2 菌株在脫脂乳中的生長(zhǎng)特性

由圖11～12可知，30 ℃培養(yǎng)條件下，8 株腸膜明串珠菌在脫脂乳中培養(yǎng)8 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，24 h后，pH值均未降至6.0以下。其中產(chǎn)酸能力最強(qiáng)的為菌株LM2，發(fā)酵終點(diǎn)處pH值降至6.08，與發(fā)酵初始相比下降0.54，這可能是由于菌株LM2乳糖利用能力較強(qiáng)；其次為菌株LM1，發(fā)酵終點(diǎn)pH值為6.12，與發(fā)酵初始相比下降0.49；而菌株LM3、LM5和LM8培養(yǎng)24 h后pH值下降幅度不超過(guò)0.20。實(shí)驗(yàn)菌株活菌數(shù)整體呈先迅速上升再緩慢增長(zhǎng)后逐漸穩(wěn)定，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)菌株在脫脂乳環(huán)境下能夠較好地生長(zhǎng)，但產(chǎn)酸情況不佳。其中，菌株LM1和LM2的產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，培養(yǎng)24 h后菌株LM2和LM6的活菌數(shù)最多，而活菌數(shù)從開(kāi)始培養(yǎng)到發(fā)酵終點(diǎn)增加最多的是菌株LM1和LM6。

2.3 根據(jù)基因預(yù)測(cè)菌株對(duì)乳糖和半乳糖的利用情況

表2 8 株腸膜明串珠菌乳糖及半乳糖不同代謝途徑（及相關(guān)酶）相關(guān)基因數(shù)量Table 2 Number of genes related to lactose and galactose in different metabolic pathway (and related enzymes) in 8 strains of L. mesenteroides

根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因信息分析實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)乳糖及半乳糖的利用能力，結(jié)合圖1和表2數(shù)據(jù)分析，8 株菌株均無(wú)PTSgal（EIIAgal、EIIBgal、EIICgal）和PTSlac（lacE/F）相關(guān)基因，說(shuō)明菌株并不能通過(guò)PTS將半乳糖和乳糖攝入胞內(nèi)，即不能將β-D-半乳糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸半乳糖，也不能將乳糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸乳糖，8 株菌株均沒(méi)有磷酸-β-半乳糖苷酶將6-磷酸乳糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸半乳糖的lacG基因。由表2可知，實(shí)驗(yàn)所用8 株腸膜明串珠菌無(wú)T6P途徑相關(guān)基因（lacA/B、lacC、lacD），說(shuō)明8 株腸膜明串珠菌只存在通過(guò)Leloir途徑代謝乳糖的可能性。各菌株Leloir途徑相關(guān)基因數(shù)量差異性不大，僅菌株LM6的galM基因數(shù)量與另外7 個(gè)菌株不同，其余基因數(shù)量全部一致。滲透酶系統(tǒng)代謝途徑中轉(zhuǎn)運(yùn)乳糖及半乳糖途徑的lacS和laZ基因數(shù)量在各菌株間的差異性較大，含lacS基因數(shù)量最多的是菌株LM2和LM8（5 個(gè)），最少的是菌株LM7（1 個(gè)）；含lacZ基因數(shù)量最多的是菌株LM2、LM4和LM8（3 個(gè)），最少的是菌株LM3、LM6和LM7（1 個(gè)）。

根據(jù)各菌株的基因與代謝途徑解析可知，除菌株LM7外，其他7 株菌乳糖代謝的相關(guān)基因（lacS、lacZ）均位于同一基因簇，基因表達(dá)較強(qiáng)，而半乳糖代謝的相關(guān)基因（galP、galM、galK、galT、galE）分布較散，大多不在同一基因簇上，基因表達(dá)較弱，這可能是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)菌株在以乳糖為單一碳源的CDM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)能力更強(qiáng)的原因。但是如想進(jìn)一步解析基因差異性與乳糖和半乳糖代謝的相關(guān)性，尚需對(duì)菌株的β-半乳糖苷酶活性、磷酸-β-半乳糖苷酶活性、發(fā)酵液中殘留乳糖及半乳糖含量等特性進(jìn)行測(cè)定。

3 結(jié) 論

通過(guò)8 株腸膜明串珠菌在不同碳源CDM培養(yǎng)基及脫脂乳環(huán)境中的生長(zhǎng)及產(chǎn)酸情況可知，不同腸膜明串珠菌對(duì)乳糖的代謝能力存在顯著差異，菌株LM1、LM2、LM4和LM8在以乳糖為單一碳源的CDM培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)最好，菌株LM2、LM3、LM5和LM8在以半乳糖為單一碳源的CDM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好。實(shí)驗(yàn)菌株在以葡萄糖為單一碳源的CDM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況優(yōu)于其他3 種環(huán)境，生長(zhǎng)量最大、活力最強(qiáng)的是菌株LM7。在脫脂乳環(huán)境下，實(shí)驗(yàn)菌株的活菌數(shù)明顯增長(zhǎng)，培養(yǎng)8 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，其中菌株LM1和LM2產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，菌株LM2和LM6活菌數(shù)最高?；蚍治霰砻鳎? 株腸膜明串珠菌不能通過(guò)PTS攝入乳糖和半乳糖，只存在通過(guò)Leloir途徑代謝乳糖的可能性，各菌株Leloir途徑相關(guān)基因差異性不大，僅菌株LM6的galM基因數(shù)量與另外7 個(gè)菌株不同。