高效液相色譜法測定新鮮煙葉中的多酚含量

黃麗佳，梁夢潔，吳雙鳳，羅 娜，季云瑞，王 雪，郭亞東，鄧 亮*

(1．昆明醫(yī)科大學 藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500；2．昆明醫(yī)科大學 計劃財務處，云南 昆明 650500)

煙草(NicotianatabacumL.)為雙子葉植物(Dicotyledoneac)，屬管花目(Tubiflorae)茄科(Solanaceae)煙草屬(Nicotiaria)，原產(chǎn)于美洲、澳大利亞和南太平洋島嶼，目前在我國各省均有廣泛種植．煙草中含有多種多酚類物質[1]，而該物質是影響煙草生長發(fā)育、煙葉色澤、煙氣香味及其生理強度等方面的重要物質．此外，多酚類物質是煙草重要的香氣前體物，與煙葉香氣量和香氣類型密切相關[2-4]，因此多酚類物質是決定煙葉品質的重要因素之一．有研究[5-7]報道了烤煙中多酚類化合物含量的測定，所用測定方法主要是采用高效液相色譜法．基于上述分析，本文采用高效液相色譜法同時測定了新鮮煙葉中10種多酚的含量．

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

對照品莨菪苷、隱綠原酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、新綠原酸、蕓香苷、莨菪亭、香豆素、山奈酚苷(純度>98%)(均購于加拿大Toronto Research Chemicals公司)；甲酸(色譜純，北京百靈威科技有限公司)，乙腈、甲醇(色譜純, 德國Merck公司)；實驗用水為超純水．

1.1.2 樣品

采自云南省石林縣耀奇香草谷的紅花大金元新鮮煙葉．

1.1.3 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(配置有二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器和色譜工作站，美國Agilent公司)；AE240電子天平(精度為 0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司)；Milli-Q50超純水儀(美國Millipore公司)．

1.1.4 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK CR(4.6 mm I.D.×250 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：340 nm；流動相流速：0.8 mL/min；流動相A[V(乙酸)∶V(甲醇)∶V(水)=2∶10∶88]，流動相B[V(乙酸)∶V(水)∶V(甲醇)=2∶10∶88]；梯度洗脫程序見表1．

表1 流動相梯度洗脫條件

1.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取莨菪苷、隱綠原酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、新綠原酸、蕓香苷、莨菪亭、香豆素、山奈酚苷等10種多酚對照品各 10.0 mg，置于 10 mL 棕色容量瓶中，用分析純甲醇溶解并定容至刻度，從而得到質量濃度為 1 mg/mL 的多酚標準儲備液．

1.3 樣品溶液的制備

精密稱取新鮮煙葉凍干粉末50.0 mg,置于 15 mL 的離心管中，然后加入80%甲醇溶液5 mL，蓋塞密封，超聲提取45 min，在常溫下，以 10 000 r/min 離心10 min，通過0.45 μm有機相微孔濾膜過濾，備用．

2 結果與分析

將多酚對照品和樣品溶液進樣后在1.1.4色譜條件下分析，其HPLC色譜圖見圖1和圖2，10個多酚分離良好，峰形對稱．

2.1 線性關系考察

通過對標準儲備液逐級稀釋，配制一系列標準工作溶液，并采用選定色譜條件對10種多酚的系列標準溶液進行測定，以對應各組分的質量濃度C為橫坐標(X)，各組分峰面積A為縱坐標(Y)，繪制工作曲線，得回歸方程及相關系數(shù)．檢出限和定量限分別取最低質量濃度標準溶液連續(xù)10次進樣，計算當信噪比S/N=3和S/N=10時所對應的檢測限和定量限，結果見表2．

表2 10種多酚的回歸方程、回歸系數(shù)、檢出限和定量限

由表2可以看出，10種多酚在1～50 μg/mL范圍內(nèi)具有較好的線性關系(r>0.999)，其檢出限在0.02～0.11 μg/mL之間，定量限在0.07～0.38 μg/mL之間．

2.2 精密度實驗

精密吸取混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，記錄色譜峰面積，得到新綠原酸、莨菪苷、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、莨菪亭、阿魏酸、香豆素、蕓香苷、山奈酚苷10種多酚的RSD值分別為0.9%，0.4%，0.5%，0.7%，1.2%，0.7%，0.6%，1.3%，1.1%，0.7%，表明儀器測定的精密度良好．

2.3 重復性實驗

取同一批次樣品6個，按1.3項下方法制備后，再按1.1.4項下色譜條件分別進樣，測定新綠原酸、莨菪苷、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、莨菪亭、阿魏酸、香豆素、蕓香苷、山奈酚苷對應的峰面積，計算其平均質量分數(shù)，得到其RSD值分別為1.3%，0.6%，1.7%，2.1%，1.3%，1.2%，1.9%，1.2%，1.5%，1.4%，表明該實驗方法重復性良好．

2.4 加標回收率

在已經(jīng)測定10種多酚含量的新鮮煙葉樣品中，分別按高、中、低 3 個質量濃度水平添加一定量的多酚混合標準溶液，連續(xù)進樣6次，測定多酚的回收率.由表3可以看出，多酚在新鮮煙葉中的平均加標回收率為：90.0%～101.4%，RSD為2.0%～4.8%．

表3 10種多酚的加標回收率和RSD (n=6)

2.5 樣品含量測定

取新鮮煙葉凍干粉，按1.3項下進行樣品前處理，在1.1.4色譜條件下進樣分析，按回歸方程計算樣品中多酚的含量，得到其平均含量從高到低的順序為：綠原酸 7 106 μg/g，云香苷 5 441 μg/g，隱綠原酸 5 237 μg/g，山奈酚苷 1 159 μg/g，新綠原酸975 μg/g，咖啡酸723 μg/g，香豆素 256 μg/g，莨菪苷89 μg/g，莨菪亭38 μg/g，阿魏酸28 μg/g．

3 討論

多酚是煙葉中的重要物質之一，本文建立的方法可以同時測定新鮮煙葉中10種多酚的含量，所用方法的精密度、重復性都較好，在設定的范圍內(nèi)，線性關系良好．回收率測定結果顯示，可以滿足實驗需要．