棗ZjRNase1 基因的克隆及功能分析

張 玉，程 壯，甄 曼，王玖瑞，劉孟軍

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河北 保定 071001； 3.北京林果業(yè)生態(tài)環(huán)境功能提升協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 100000）

核糖核酸酶（Ribonucleases）是一類核酸水解酶，廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)。它可以降解非保護(hù)環(huán)境下的RNA 分子，其主要生理功能是控制生物體細(xì)胞內(nèi)RNA 的種類與數(shù)量分布，在核糖核酸轉(zhuǎn)錄后的剪切、修飾和降解以及RNA 的轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程中起作用，通常被簡(jiǎn)寫(xiě)為RNases。RNases 不僅與植物的抗逆、衰老、雄性不育和自交不親和有密切關(guān)系，還與動(dòng)物器官發(fā)生、宿主的防御、控制腫瘤血管生成、殺滅腫瘤細(xì)胞及抑制病毒的復(fù)制等過(guò)程有關(guān)［1-2］。Sato和Egami 于1957 年從真菌米曲霉菌中發(fā)現(xiàn)了該家族中的重要成員核糖核酸酶T2 基因［3］。RNases T2家族屬于酸性內(nèi)切酶類，在真核生物的進(jìn)化過(guò)程中，此類酶絕對(duì)保守，可能有著重要的生物學(xué)功能［4］。近幾年，關(guān)于植物RNases T2 家族成員的研究取得了很大進(jìn)展，揭示出其在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆反應(yīng)等過(guò)程發(fā)揮重要作用［5］。

棗（Ziziphus jujuba Mill.）屬鼠李科（Rhamnaceae）棗屬（Ziziphus），由酸棗馴化而來(lái)，是重要的干果樹(shù)種且可以藥食兩用。棗果實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，但棗結(jié)實(shí)率不高，百花結(jié)一果［6］。棗樹(shù)抗逆性強(qiáng)，適應(yīng)干旱、鹽堿等惡劣條件，是改善生態(tài)的先鋒樹(shù)種。隨著棗全基因組測(cè)序工作的完成［7］，棗生長(zhǎng)發(fā)育和抗性等相關(guān)的功能基因的挖掘正深入展開(kāi)，已經(jīng)涉及棗MADS-box 家族［8］、TCP 家族［9］和bHLH［10］等家族基因，但未見(jiàn)RNase T2 家族Class I 基因的報(bào)道。本研究基于已經(jīng)報(bào)道的擬南芥RNase T2 家族中Class I 的RNS1 基因［11］，克隆獲得了棗同源ZjRNase1 基因，并對(duì)其進(jìn)行了理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守域結(jié)構(gòu)和不同組織器官的表達(dá)量分析，在此基礎(chǔ)上還進(jìn)行了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，以探究該基因的功能。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)棗中心棗資源圃，選取‘冬棗’葉片作為ZRNase1 基因的克隆材料，根、莖、葉、花和幼果作為ZjRNase1 基因不同組織表達(dá)量的分析材料。試驗(yàn)材料在田間采集后包裹進(jìn)錫箔紙中，迅速保存在液氮里，帶回室內(nèi)后存于-80 ℃，用作后續(xù)RNA 提取。每個(gè)樣品均采自3 棵樹(shù)，然后進(jìn)行混樣，采樣植株具有相同的生長(zhǎng)年齡、栽培條件和管理水平。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 棗ZjRNase1 基因的克隆 通過(guò)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)Blastp 查找擬南芥RNS1 在棗中的同源序列，利用Primer5.0 軟件設(shè)計(jì)所需的特異引物（F： ATGAGATACAGAAGCTCAATCTTGA / R： CTAAAATTTAGCAAATTGAACTTGA）進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。以‘冬棗’葉片反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為：引物F/R 各1 μL，2×Taq PCR MasterMix 為12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，cDNA 1 μL。反應(yīng)條件為94 ℃ 10 min， 94 ℃ 40 s，56.6 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共35 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。回收擴(kuò)增獲得的目的片段產(chǎn)物，并克隆測(cè)序。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn) 行Blastp 比對(duì)分析氨基酸序列的相似性，查找同源蛋白序列；通過(guò)CD Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行序列的結(jié) 構(gòu)域分析；利用NCBI 開(kāi)放閱讀框在線預(yù)測(cè)軟件 ORF Finder（http：//www.ncb i.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）對(duì)獲得的基因序列進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用DNAMAN 進(jìn)行序列比對(duì)和拼接；利用GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析；利用ExPASy（https：//www.expasy.org/）計(jì) 算 蛋 白 質(zhì) 相對(duì)分子量和理論等電點(diǎn)；通過(guò)SOPMA 在線軟件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對(duì)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用SignaIP-5.0 Serve（rhttp：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)該基因的信號(hào)肽；利用Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）在線網(wǎng)站進(jìn)行細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；用MEME（http：//meme-suite.org/）進(jìn)行氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域分析。1.2.3 基因的表達(dá)分析 取用‘冬棗’不同組織器官cDNA 進(jìn)行Real-time PCR 擴(kuò)增。采用天根公司多糖多酚植物總 RNA 提取試劑盒 DP441 提取棗材料總RNA，使用全式金公司Trans Script First-Strand cDNA Synthesis SuperMix AT301 反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA。設(shè)計(jì)棗ZjRNase1 實(shí)時(shí)定量基 因 引 物（2F：GCTGTCCAAGTAGCAACGGA / 2R：CCCTGTTGCAGTCAATCCCT）， 進(jìn)行 表 達(dá) 量 的 分 析， 棗Actin 內(nèi) 參 基 因 為（F：5′-GCGAGCTTCCCTGTAGGTA-3′，R：5′-CG- AACCCAGCCTTCACCATAC-3′［12］）。PCR 反應(yīng) 程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s， 59.2 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，共40 個(gè)循環(huán)，于72 ℃，55 s 處收集熒光信號(hào)。基因相對(duì)表達(dá)計(jì)算采用2-ΔΔCT方法。

1.2.4 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建PCR 獲得基因片段 根據(jù)NCBI 登錄的基因序列，并含有SmaΙ 酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物如下（3F：CTCTAGGATCCCCATGAGAT ACAGAAGCTCAATCTTGA / 3R：AGGGACTG AC CACCCCTAAAATTTAGCAAATTGAACTTGA） 所示，以已有全長(zhǎng)菌液為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性40 s， 58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物克隆pMD19-T 載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞測(cè)序。

載體的構(gòu)建及鑒定：將上述重組質(zhì)粒及過(guò)表達(dá)載體pBI121 用SmaΙ 酶切后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳回收DNA 片段。平末端連接酶50 ℃連接30 min后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，利用Kan 篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序鑒定為相應(yīng)片段，提取質(zhì)粒。

農(nóng)桿菌菌株的制備及鑒定：參考梁芳等人［13］的具體制備及鑒定方法。

1.2.5 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因鑒定 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，將構(gòu)建好的過(guò)表達(dá)載體采用浸染花序的方式轉(zhuǎn)化擬南芥，轉(zhuǎn)化方法參考李業(yè)等人［14］。將侵染后收獲的T0代轉(zhuǎn)基因植株和野生型種子使用相同的方法種植和移栽。T0代擬南芥種子播于含有潮霉素抗性的1/2MS 培養(yǎng)基上，春化2 d 后放置培養(yǎng)室培養(yǎng)。非轉(zhuǎn)入目的基因的擬南芥不具有抗性而被抗生素殺死，正常生長(zhǎng)的擬南芥初步預(yù)測(cè)為轉(zhuǎn)基因植株，待其長(zhǎng)到4 片子葉時(shí)移栽，正常放置培養(yǎng)室內(nèi)生長(zhǎng)，觀察生長(zhǎng)狀態(tài)。

2 結(jié)果和分析

2.1 棗ZjRNase1 基因的克隆及結(jié)構(gòu)分析

將擬南芥RNS1 氨基酸序列在棗數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blastp 比對(duì)，搜索得到了一個(gè)同源蛋白，序列同源性為63.35%， 將其命名為ZjRNase1（LOC107429010）。以冬棗葉片RNA 反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，經(jīng)特異引物PCR 擴(kuò)增所得產(chǎn)物，與預(yù)期基因片段大小吻合（圖1）。將該片段進(jìn)行切膠回收并克隆測(cè)序后，將測(cè)序結(jié)果通過(guò) DNAMAN 進(jìn)行序列比對(duì)，得到681 bp 的完整ORF 區(qū)序列。利用在線網(wǎng)站GSDS 分析（圖2）發(fā)現(xiàn)該基因含有2個(gè)內(nèi)含子和3 個(gè)外顯子。

圖 1 ZjRNase1 基因的克隆Fig. 1 Cloning of ZjRNase1 gene

圖 2 棗ZjRnase1 基因結(jié)構(gòu)圖Fig. 2 Gene structure of ZjRnase1 gene in Chinese jujube

2.2 棗ZjRNase1 基因的理化性質(zhì)分析及亞細(xì)胞 定位

棗ZjRNase1 基因編碼226 個(gè)氨基酸，蛋白分子量為25.78 kD，理論分子式C2090H3501N681O882S132，該蛋白GRAVY（即總平均親水性）值為0.707，表明其為疏水性蛋白。該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為42.66，其值大于40，說(shuō)明該蛋白是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白。該基因編碼的氨基酸中由75 個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)（33.19%）、30 個(gè)擴(kuò)展鏈（13.27%）、113 個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲氨基酸殘基（50.00%）、8 個(gè)β-轉(zhuǎn)角（3.54%）組成，它們交替散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。RNase1 蛋白在第1 ～6 氨基酸處位于膜內(nèi)，在7 ～26 氨基酸處存在跨膜現(xiàn)象，第27 ～226 氨基酸處則位于膜外；經(jīng)SignalP-5.0 Server 在線網(wǎng)站分析（圖3）。該蛋白含有信號(hào)肽，屬于分泌蛋白。經(jīng)Plant-mPLoc 在線網(wǎng)站分析，基因定位在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)。

圖 3 ZjRNase1 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)及信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig. 3 Prediction of transmembrane structure and signal peptides

2.3 棗ZjRNase1 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

從基因結(jié)構(gòu)來(lái)看，基因ZjRnase1 內(nèi)含子沒(méi)有超過(guò)4 個(gè)，不屬于Class II 類基因，故將該基因的蛋白與Class III 基因（即S-RNase）蛋白及Class I 蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。與其他十個(gè)物種的S 蛋白進(jìn)行保守域比較，發(fā)現(xiàn)該蛋白與其他物種Class III 基因蛋白僅具有部分大體一致的保守結(jié)構(gòu)（圖4），但與屬于Class I 的擬南芥中的RNS1、RNS3、番茄中的RNaseLE、RNaseLX 以及水稻OsRNS4蛋白［17］保守域結(jié)構(gòu)具有高度相似性，因此，獲得的棗Rnase1基因應(yīng)屬于RNase T2家族中Class I 基因。

圖 4 棗ZjRnase1 與其他物種同源蛋白的保守域分析Fig.4 Analysis of the conserved domain of ZjRnase1 among Chinese jujube and other species

2.4 棗ZjRNase1 基因的組織特異性分析

經(jīng)組織器官特異性表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，棗ZjRNase1基因在莖、葉、花中表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于果實(shí)和根，具有明顯的特異性表達(dá)（圖5），符合RNase T2 家族中Class I 基因編碼蛋白具有很強(qiáng)組織特異性的特征［17］。

圖 5 棗不同組織器官中ZjRNase1 基因的表達(dá)Fig. 5 Expression of ZjRNase1 gene in different organs of Chinese jujube

2.5 棗ZjRNase1 基因的遺傳轉(zhuǎn)化分析

2.5.1 重組載體的構(gòu)建 重組質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化之后，在相應(yīng)抗性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，長(zhǎng)出單菌落并對(duì)其進(jìn)行特異性擴(kuò)增，保菌送測(cè)序，并留菌保存用于后續(xù)將載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，進(jìn)行擬南芥的侵染。使用引物3F/3R 對(duì)構(gòu)建的過(guò)表達(dá)載體及轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌后擴(kuò)繁好的載體進(jìn)行特異性擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果如圖6 所示，與目的基因大小一致。

圖6 目的片段的PCR 檢測(cè)Fig. 6 PCR detection of target fragments

2.5.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表型特征 經(jīng)潮霉素抗性篩選，從T0代擬南芥種子獲得了T1代抗性植株，可在含潮霉素的培養(yǎng)基上生根生長(zhǎng)。移栽后繼續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，與野生型（WT）相比T1代抗性植株（MT）葉片發(fā)生明顯扭曲現(xiàn)象。因此，外源ZjRnase1 基因轉(zhuǎn)入導(dǎo)致擬南芥葉片發(fā)育異常，說(shuō)明ZjRnase1 基因可能參與了葉片發(fā)育過(guò)程（圖7）。

圖 7 棗ZjRnase1 基因轉(zhuǎn)化擬南芥Fig. 7 Transformation of Arabidopsis with Chinese jujube ZjRNase1 gene

3 討論與結(jié)論

植物RNase T2 家族分為S-RNases 和S-like RNases 兩類［1,15］，也可以依據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析分為三大類。 第一類和第二類為S-like RNases 基因，S-RNases 則為第三類，不同類別含有的內(nèi)含子的拷貝數(shù)量和位置存在差異［16］。第一類含有來(lái)自許多高等植物的非S-RNase 基因，其中一些酶由于保守活性區(qū)域發(fā)生突變而失去核酸酶活性。這類酶具有多重復(fù)制子，其基因組中一般不超過(guò)4 個(gè)內(nèi)含子，且具有很強(qiáng)的組織特異性，可能會(huì)因?yàn)榄h(huán)境脅迫而被誘導(dǎo)。第二類基因普遍存在于大多數(shù)植物中，內(nèi)含子多于4 個(gè)，典型的Class II 成員有7 個(gè)或8 個(gè)內(nèi)含子。其酶在N 末端有獨(dú)特的一個(gè)保守的二硫化物結(jié)構(gòu)，多在植物中組成性表達(dá)，具有明顯的保守遺傳特征。第三類基因內(nèi)含子數(shù)目一般為1 ～2 個(gè)。該類基因存在于存在于玄參科、茄科、薔薇科等植物的花中，可以降解轉(zhuǎn)運(yùn)花粉管中的RNA（tRNA），在植物配子體不親和性中起作用［17］。本研究中獲得的ZjRnase1 基因具有2 個(gè)內(nèi)含子，其表達(dá)具有器官組織特異性，其蛋白與擬南芥等物種中屬于RNase T2 家族Class I 基因編碼的蛋白具有高度相似的保守結(jié)構(gòu)，因此，棗ZjRnase1 屬于為RNase T2 家族的Class I 基因［16-17］。

擬南芥中的RNS1、RNS3，番茄中的RNaseLE和RNaseLX，以及水稻中的OsRNS4 屬于RNase T2家族的Class I 基因［16-17］，這些基因參與了生長(zhǎng)發(fā)育與抗逆反應(yīng)。番茄RNaseLX 基因可以木質(zhì)部分化過(guò)程［18］或磷酸鹽缺失［19］的情況下表達(dá)；反義抑制RNaseLX 可以延緩葉片脫落［20］；離體葉片在黑暗脅迫［21］下可以誘導(dǎo)番茄中的RNaseLE 和RNaseLX基因表達(dá)；損傷后RNaseLE 轉(zhuǎn)錄物優(yōu)先在莖段的韌皮部和形成層細(xì)胞中積累，在傷口愈合中發(fā)揮作 用［18］。此外，Theierl K 等人研究提出了擬南芥中的RNS1 基因會(huì)在機(jī)械傷口下被快速誘導(dǎo)表達(dá)［11,22］。水稻中的OsRNS4 基因會(huì)在蟲(chóng)害或傷口損壞及病原菌侵染植株時(shí)被誘導(dǎo)，而且過(guò)表達(dá)OsRNS4 基因會(huì)增加植株的耐鹽性，且正調(diào)控ABA 反應(yīng)［23］。因此，該類基因在葉片發(fā)育和寄主的防衛(wèi)反應(yīng)過(guò)程起到了重要作用，但是具體反應(yīng)機(jī)制以及RNase 活性是否為非生物脅迫抵抗不良環(huán)境所必須的，還有待考 證［24］。本研究將棗ZjRNase1 基因轉(zhuǎn)入擬南芥，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株葉片發(fā)生明顯卷曲現(xiàn)象。因此，初步明確了該基因參與葉片發(fā)育過(guò)程，但具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。