淫羊藿藥材及飲片質量分析與標準制定△

王常順，段吉平，康帥，袁浩，劉永利*，馮麗*

1.河北省藥品檢驗研究院/國家藥品監(jiān)督管理局中藥材質量監(jiān)測評價重點實驗室，河北 石家莊 050227；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

淫羊藿為常用中藥材，始載于《神農本草經》[1]，以后歷代本草多有收錄，《中國人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)自1963年版開始收載，來源、藥用部位等幾經變化，見表1。2015年版收載了淫羊藿(以下稱心葉淫羊藿)、箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿、朝鮮淫羊藿4個來源。飲片有2種，一種切絲(以下稱淫羊藿絲)，一種加羊油炒(以下稱炙淫羊藿)?，F(xiàn)行質量標準藥材與淫羊藿絲用紫外-可見分光光度法測定總黃酮和HPLC測定淫羊藿苷含量，炙淫羊藿的含量測定增加了寶藿苷Ⅰ，其他基本與藥材相同[2]。

近些年，對朝鮮淫羊藿中淫羊藿苷含量不合格情況反映較多，甚至有經營者為了符合《中國藥典》要求而采用加熱等技術手段提高淫羊藿苷含量[3-7]，嚴重影響了藥材與飲片質量。為此，筆者從2013年開始，從中藥材專業(yè)市場、飲片生產企業(yè)、

表1 歷版《中國藥典》淫羊藿來源與藥用部位、炮制方法變化

飲片經營使用單位、種植基地、產地等陸續(xù)收集了104批樣品，研究建立了一標多測的含量測定方法，將測定淫羊藿苷單個成分修訂為同時測定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C與淫羊藿苷4個成分，通過對藥材與飲片的含量進行統(tǒng)計分析制定限度，使質量標準能更加科學合理，實現(xiàn)了從整體上控制藥材質量，也防止了種植者、經營者為提高《中國藥典》中的某個指標成分而采取所謂的“技術手段”。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀：Agilent 1260(美國安捷倫公司，四元泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器)；電子天平：Mettler XPE26(瑞士Mettler公司，0.001 mg)，Mettler XS105DU(瑞士Mettler公司，0.01 mg)；超純水儀(美國Millipore公司)。

1.2 試藥

朝藿定A對照品(上海詩丹德標準技術服務有限公司，批號：110623-72-8，以100.0%計)；朝藿定B對照品(上海詩丹德標準技術服務有限公司，批號：110623-73-9，以100.0%計)；朝藿定C(中國食品藥品檢定研究院，批號：111780-200801，以99.1%計)；淫羊藿苷(中國食品藥品檢定研究院，批號：110737-201516，以94.2%計)；寶藿苷Ⅰ(中國食品藥品檢定研究院，批號：111852-201603，以99.9%計)；甲醇、乙腈為色譜純(德國Merk公司)；乙醇為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈為流動相A，水為流動相B，梯度洗脫(0～30 min，24%～26%A，30～31 min，26%～45%A，31～45 min，45%～47%A)；檢測波長：270 nm；流速：1 mL·min-1；進樣量：10 μL。4種基原藥材色譜見圖1。

注：A.混合對照品；B.心葉淫羊藿；C.朝鮮淫羊藿；D.柔毛淫羊藿；E.箭葉淫羊藿；1.朝藿定A；2.朝藿定B；3.朝藿定C；4.淫羊藿苷；5.寶藿苷Ⅰ。圖1 淫羊藿對照品及樣品HPLC圖

2.2 對照品溶液制備

取淫羊藿苷對照品5.125 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取10 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得。

2.3 供試品溶液制備

取本品葉片粉末(過三號篩)約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，稱定質量，超聲處理(功率：400 W，頻率：50 kHz)1 h，再稱定質量，用稀乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關系考察

分別稱取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷I對照品5.094、5.187、5.489、5.372、3.310 mg，加甲醇配成系列濃度溶液，進樣測定，記錄峰面積。以峰面積積分值為縱坐標，對照品進樣量為橫坐標繪制標準曲線，5種成分線性關系良好，見表2。

2.5 重復性試驗

取心葉淫羊藿粉末，混勻，稱取粉末0.1、0.2、0.3 g各3份，精密稱定，按2.3項下方法制成供試品溶液，按2.1色譜條件測定，結果朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷I質量分數(shù)分別為1.65、3.81、6.33、7.29、1.49 mg·g-1，RSD分別為1.2%、0.8%、1.6%、1.1%、1.2%，表明本方法的重復性良好。

2.6 回收率試驗

取已知含量的心葉淫羊藿粉末，每份約0.1 g，精密稱定，分別加入高、中、低濃度的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷I混合對照品溶液20 mL，再按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件測定，計算回收率。結果見表2。表明本方法回收率良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別于0、1、2、5、12、15、24 h進樣測定，記錄峰面積積分值，結果朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷I峰面積積分值RSD分別為1.2%、1.3%、1.2%、1.2%、1.3%。表明供試品溶液在室溫下放置，至少24 h內穩(wěn)定。

3 一標多測研究

淫羊藿苷與朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C等均為黃酮醇苷類化合物，母核結構相同，見圖2。為簡化實驗，以淫羊藿苷對照品為參照進行了一標多測研究，對校正因子進行了測定與耐用性考察。

圖2 淫羊藿苷與朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C分子結構

3.1 色譜條件

色譜條件同2.1。

3.2 相對保留時間和校正因子(f)的測定

分別精密稱取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷對照品各3份，加甲醇配制成系列濃度溶液，注入液相色譜儀，測定峰面積，繪制標準曲線(r均為0.999 9)，見表3。采用標準曲線法計算校正因子f，結果朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的校正因子分別為1.35、1.28、1.22，RSD分別0.8%、0.9%、1.2%；相對保留時間分別為0.73、0.81、0.90，RSD分別為0.4%、0.1%、0.4%。

f=ks/ki

(1)

ks表示參照物標準曲線斜率。ki表示待測成分標準曲線斜率。

3.3 外標法測定含量與校正因子一標多測法測定含量對比

將外標法計算的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷與一標多測法計算結果進行了對比，結果RSD均小于3%，統(tǒng)計分析差異無統(tǒng)計學意義，表明外標法與一標多測法測定結果一致。

4 含量限度制定

104批淫羊藿藥材與飲片含量測定結果見表4。因市場上基本沒有箭葉淫羊藿，收集到的5批箭葉淫羊藿樣品均來自貴州雷山栽培基地，不具代表性，因此不做分析。

表3 一標多測校正因子測定各成分標準曲線測定數(shù)據

表4 淫羊藿藥材與飲片含量測定結果 %

續(xù)表4

續(xù)表4

續(xù)表4

從總黃酮醇苷含量箱式圖(見圖3)可以看出，淫羊藿藥材與淫羊藿絲含量基本相同，而炙淫羊藿含量較低，而且淫羊藿絲炮制方法為簡單切制，因此將藥材與淫羊藿絲一起統(tǒng)計分析，制定限度。

圖3 淫羊藿藥材、淫羊藿絲、炙淫羊藿總黃酮醇苷含量箱式圖

朝鮮淫羊藿4個成分總和為0.5%～2.5%，其他3種淫羊藿為1.5%～13.2%，炙朝鮮淫羊藿4個成分總和為0.4%～1.8%，其他3種炙淫羊藿為0.9%～2.6%。從各成分含量統(tǒng)計圖(圖4～6)可以看出，朝鮮淫羊藿含量與其他種差異明顯。方差分析結果表明，朝鮮淫羊藿與其他基原差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖4 淫羊藿藥材及淫羊藿絲含量分布箱式圖

圖5 淫羊藿藥材及淫羊藿絲含量分布面積圖

圖6 炙淫羊藿含量分布箱式圖

將含量測定數(shù)據輸入SPSS 22.0 軟件，對樣品進行聚類分析，采用組間連接法，以歐式平方距離為分類依據，結果見圖7～8，由藥材和淫羊藿絲聚類結果可見，朝鮮淫羊藿基本聚為一類，心葉淫羊藿有17批聚為一類，另外批次與柔毛淫羊藿聚為一類，表明總黃酮醇苷含量主要與基原有關，與產地、采收時間等可能也有一定聯(lián)系。由炙淫羊藿聚類結果可見，炙朝鮮淫羊藿聚為一類，炙心葉淫羊藿聚為一類。

圖7 淫羊藿藥材及淫羊藿絲含量測定結果聚類分析

圖8 炙淫羊藿含量測定結果聚類分析

目前市場上主要以心葉淫羊藿與朝鮮淫羊藿為主，柔毛淫羊藿與箭葉淫羊藿較少見，而朝鮮淫羊藿中各成分含量與其他種淫羊藿有顯著性差異，因此建議將朝鮮淫羊藿限度單列。根據樣品測定數(shù)據，藥材與淫羊藿絲限度為：朝鮮淫羊藿含朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷總量不得低于0.50%。淫羊藿、柔毛淫羊藿、箭葉淫羊藿不得低于1.5%。炙淫羊藿限度為：朝鮮淫羊藿含朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷總量不得低于0.40%。其余3個來源不得低于1.2%；4個來源的寶藿苷I均不得低于0.030%。據此限度，104批樣品中只有1批炙淫羊藿總黃酮醇苷(柔毛，YYH004)為0.9%，不符合規(guī)定，其余103批均符合規(guī)定，合格率為99.0%。

5 討論

5.1 炮制方法

淫羊藿為復葉，葉柄較多，根據文獻報道[8-10]及實測結果，葉柄含量低于葉片，《雷公炮炙論》記載“須用夾刀夾去葉四畔花栨”，即藥用實際上是葉片，因此炮制方法建議恢復2010年版《中國藥典》以前描述，“摘取葉片，除去雜質……切絲”，即藥材帶葉柄，炮制時只取葉片，與本草及用藥習慣相符。

5.2 關于含量測定取樣部位

藥材在測定時若不規(guī)定摘取葉片，則每次取樣時含葉柄的多少將使測定結果相差較大，致使同一批樣品測定結果重復性差。另外，淫羊藿炮制時規(guī)定摘取葉片，即實際應用的是葉片，因此藥材測定也摘取葉片測定，就與飲片規(guī)定一致，同一批藥材與飲片的含量易于追溯。

5.3 含量測定方法考察

對提取方式、提取時間等進行了考察優(yōu)化，對不同色譜柱、儀器、柱溫、流速等耐用性等進行了考察；一標多測考察了5臺儀器、5根色譜柱及柱溫、流速、波長等因素對相對保留時間和校正因子的影響，結果RSD均小于2%，表明方法耐用性良好；綜合標準復核單位浙江省食品藥品檢驗研究院、成都市食品藥品檢驗研究院結果，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的校正因子分別為1.35、1.28、1.22，相對保留時間分別為0.73、0.81、0.90。

5.4 朝鮮淫羊藿色譜分離度問題

朝鮮淫羊藿色譜中淫羊藿苷分離度差原因分析可能為淫羊藿藥材中含有的1種淫羊藿苷的前體化合物3-羰基-2″-β-L-喹諾糖基淫羊藿苷(3-carbonyl-2″-β-L-quinovosyl-icariin)，在分析淫羊藿苷類成分的色譜條件下，表現(xiàn)為前伸峰，峰高較低，其他3個基原含量較高，難以察覺[11-12]。

5.5 限度制定

根據統(tǒng)計分析，朝鮮淫羊藿與其他3個基原在淫羊藿苷等4種成分差異有統(tǒng)計學意義，因此將朝鮮淫羊藿限度單列。柔毛淫羊藿、箭葉淫羊藿目前市場極少見，樣品代表性差，今后將繼續(xù)收集樣品，積累數(shù)據，制定更加科學嚴謹?shù)馁|量標準。

5.6 薄層鑒別

現(xiàn)行質量標準還收載了以淫羊藿苷對照品的薄層色譜鑒別，但背景較重，斑點分離度差。本研究嘗試對方法進行了優(yōu)化，但是不同基原的淫羊藿藥材主斑點個數(shù)、斑點大小、顏色等差異較大，難以建立統(tǒng)一的方法，今后將繼續(xù)進行研究。

5.7 其他項目測定

對所有藥材與飲片均測定了總黃酮、浸出物、水分、總灰分等項目，結果均符合《中國藥典》2015年版要求，表明現(xiàn)行標準限度合理。