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    鹿瓜多肽注射劑質(zhì)量評(píng)價(jià)與研究

    2020-09-14 02:09:20周朝東伏圣青稅鳳春黃哲甦
    關(guān)鍵詞:鹿瓜黃曲霉注射劑

    蘇 喆,周朝東,馬 冰,張 晶,伏圣青,王 沖,稅鳳春,黃哲甦

    (天津市藥品檢驗(yàn)研究院,天津300070)

    鹿瓜多肽注射劑包括鹿瓜多肽注射液和注射用鹿瓜多肽,屬于多組分生化藥。鹿瓜多肽注射劑是從動(dòng)物梅花鹿骨骼和中草藥甜瓜子中分離、提取制成的滅菌水溶液或無(wú)菌凍干品。無(wú)菌凍干品的輔料為甘露醇或右旋糖酐40。鹿瓜多肽注射劑的主要成分鹿骨提取物中含有骨誘導(dǎo)多肽、多種游離氨基酸,以及鈣、磷等活性因子,可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,促進(jìn)骨折愈合;甜瓜子提取物富含多肽、不飽和脂肪酸,可以降低毛細(xì)血管通透、減少炎性滲出,有效緩解各種炎性癥狀。鹿瓜多肽注射劑臨床上主要用于風(fēng)濕、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、各種類(lèi)型骨折、創(chuàng)傷修復(fù)等[1]。

    目前鹿瓜多肽注射劑在我國(guó)共有3 家企業(yè)生產(chǎn),7 個(gè)國(guó)藥準(zhǔn)字批準(zhǔn)文號(hào)?,F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)包括:國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn) WS1-XG-002-2002-2005、試行標(biāo)準(zhǔn)YBH12682005(8 mg)/ YBH12432006(16 mg)/YBH13522006(24 mg)、試行標(biāo)準(zhǔn)YBH13342005及補(bǔ)充申請(qǐng)批件2006B01192。歷版《中華人民共和國(guó)藥典》及國(guó)外藥典均未收載鹿瓜多肽注射劑。

    國(guó)家藥品監(jiān)督管理局將鹿瓜多肽注射劑列入2019 年國(guó)家藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)計(jì)劃,隸屬于多組分生化藥專(zhuān)項(xiàng)。此次國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品監(jiān)督管理司共抽樣鹿瓜多肽注射劑69 批次,其中注射用鹿瓜多肽有4、8、16 和24 mg 4 種規(guī)格;鹿瓜多肽注射液有2 mL∶4 mg和4 mL∶8 mg兩種規(guī)格。

    在對(duì)生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行實(shí)地調(diào)研及樣品法定檢驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)了如下問(wèn)題:(1)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)暫無(wú)樣品新鮮度質(zhì)控項(xiàng)目。現(xiàn)場(chǎng)調(diào)研時(shí)發(fā)現(xiàn)甜瓜子原料存在霉變、酸敗的現(xiàn)象,中間提取液存在反復(fù)凍融的情況,且企業(yè)未對(duì)生物胺、真菌毒素、酸價(jià)及過(guò)氧化值等影響產(chǎn)品新鮮度的指標(biāo)進(jìn)行控制;(2)現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)WS1-XG-002-2002-2005 未對(duì)高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)進(jìn)行控制;其余質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均采用凝膠色譜法測(cè)定高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)。經(jīng)法定檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),由于制劑成分非常復(fù)雜,色譜流出峰難以有效分離,對(duì)積分和定量都造成一定困難,導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確;(3)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)缺失溶血與凝聚、生物學(xué)活性測(cè)定項(xiàng)目,無(wú)法從安全性、有效性方面控制產(chǎn)品質(zhì)量;(4)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)采用福林酚法測(cè)定多肽含量,該法存在輔料干擾、對(duì)照品和供試品溶解稀釋所用溶劑不一致的情況?;谏鲜鰡?wèn)題,本研究開(kāi)展一系列探索,包括建立新鮮度質(zhì)量屬性的檢測(cè)項(xiàng)目、優(yōu)化高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)和多肽含量測(cè)定檢測(cè)方法、考察溶血與凝聚及生物學(xué)活性測(cè)定,從安全性、有效性角度系統(tǒng)研究鹿瓜多肽注射劑的質(zhì)量狀況,以期為鹿瓜多肽注射劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善奠定理論基礎(chǔ)。

    1 材 料

    1.1 藥品與試劑

    8 種生物胺對(duì)照品,包括:組胺、酪胺、尸胺、腐胺、2-苯乙胺、色胺、精胺、亞精胺(純度均大于98.0%,美國(guó)Sigma-Aldrich公司);黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液(批號(hào)LC01086,含黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2質(zhì) 量 濃 度 分 別 為:0.961、0.280、0.903、0.296μg/mL,美國(guó)Supelco公司);黃曲霉毒素免疫親和柱(AflaTest,1 mL,美國(guó)Vicam 公司);核糖核酸酶A(批號(hào)E1624067,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);超低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker(3.3-20.1 kD,北京索萊寶科技有限公司);Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay 多肽含量測(cè)定試劑盒(批號(hào)UD286404C,美國(guó)Thermo Fisher 公司);牛血清白蛋白(批號(hào)SLBC3968V,美國(guó)Sigma-Aldrich 公司);RPMI 1640 培養(yǎng)基(批號(hào)0022919,以色列Biological Industries 公司);胎牛血清(FBS)(批號(hào)1913445,以色列Biological Industries 公司);CCK-8 試劑盒(批號(hào)NY652,日本同仁化學(xué)研究所);乙腈、甲醇為色譜純(德國(guó)Merck 公司);實(shí)驗(yàn)用水為Millipore 超純水;其余試劑均為市售分析純。鹿瓜多肽注射劑均為2019年國(guó)家藥品抽驗(yàn)計(jì)劃樣品(69 批,來(lái)自3 個(gè)生產(chǎn)企業(yè));鹿瓜多肽中間提取液、甜瓜子原料均由3個(gè)生產(chǎn)企業(yè)提供。

    1.2 儀 器

    Waters e2695 高效液相色譜系統(tǒng),配2489 UV/Vis 紫外檢測(cè)器、Aura Industries 光化學(xué)衍生器(254 nm紫外燈衍生光源)及2475 FLR熒光檢測(cè)器(美國(guó)Waters 公司);T50 自動(dòng)電位滴定儀、XS205電子天平(瑞士Mettler Toledo 公司);Mini-Protean Tetra 垂直電泳系統(tǒng)及Universal Hood Ⅱ凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad 公司);Varioskan Flash 多功能酶標(biāo)儀、HERAcell 240i 二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher 公司);CF16RXII 冷凍離心機(jī)(日本Hitachi 公司);R-215 專(zhuān)業(yè)型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi 公司);ECLIPSE TS100-F 倒置顯微鏡(日本Nikon 公司);SpectraMax M2 多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices 公司);純化水儀(美國(guó)Millipore公司)。

    1.3 細(xì)胞株

    人髓系白血病單核細(xì)胞株(THP-1),購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司;以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng),定期傳代。

    1.4 動(dòng) 物

    家兔(2.5~3.3 kg,普通級(jí))購(gòu)自天津裕達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司,合格證號(hào):0010784。

    2 方 法

    2.1 生物胺的測(cè)定

    生物胺是食品或藥材新鮮程度和被微生物污染程度的標(biāo)志[2]。本研究以丹磺酰氯為衍生試劑,衍生化RP-HPLC 法測(cè)定鹿瓜多肽注射劑中的生物胺類(lèi)成分。

    2.1.1 溶液的制備 對(duì)照品溶液:取8 種生物胺對(duì)照品各適量,精密稱(chēng)定,分別置10 mL量瓶中,用0.1 mol/L 鹽酸溶液制成每1 mL 中約含各生物胺2.5 mg 的溶液,作為對(duì)照品貯備液。分別量取各生物胺對(duì)照品貯備液1.0 mL,置同一25 mL 量瓶中,用0.1 mol/L 鹽酸溶液稀釋至刻度,搖勻,制得生物胺混合對(duì)照品溶液(0.1 mg/mL);精密量取此混合對(duì)照品溶液0.01,0.10,0.50,1.00,2.00,5.00 mL,分別置10 mL 量瓶中,用0.1 mol/L 鹽酸溶液稀釋至刻度,搖勻,制得0.10,1.00,5.00,10.00,20.00,50.00 μg/mL 的系列混合對(duì) 照 品溶液。

    供試品溶液:取鹿瓜多肽注射液(A 企業(yè)),作為供試品溶液;取注射用鹿瓜多肽(B、C 企業(yè)),用0.1 mol/L 鹽酸溶液溶解并稀釋制成2 mg/mL 的溶液(以多肽計(jì)),作為供試品溶液。

    空白溶劑:取0.1 mol/L 鹽酸溶液,作為空白溶劑。

    衍生劑溶液:精密稱(chēng)取丹磺酰氯適量,用丙酮制成10 mg/mL的溶液,作為衍生劑溶液。

    精密量取上述系列混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白溶劑各0.5 mL,依次加入衍生劑溶液1 mL、飽和碳酸氫鈉溶液0.3 mL 與氫氧化鈉溶液(2 mol/L)0.2 mL,60 ℃水浴避光反應(yīng)30 min,取出加入氨水(1∶1)0.2 mL,室溫避光反應(yīng)30 min,加乙酸乙酯5 mL 提取3次,合并提取液,40 ℃水浴氮?dú)獯蹈桑蛹状?.0 mL 溶解殘留物,用0.22μm 有機(jī)濾膜濾過(guò),進(jìn)行HPLC測(cè)定。

    2.1.2 色譜條件 采用Inertsil ODS-3 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以水(A)-90%乙腈(B)為流動(dòng)相,梯度洗脫(0~30 min,50%B→100%B;30~38.5 min,100% B;38.5~39 min,100% B→50% B;39~43 min,50% B),檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量30μL。

    2.1.3 專(zhuān)屬性 取生物胺混合對(duì)照品溶液(10μg/mL)、供試品溶液(批號(hào)120180407)和空白溶劑分別進(jìn)行衍生,并進(jìn)樣分析。

    2.1.4 線性關(guān)系、定量限及檢測(cè)限 精密量取衍生后的系列混合對(duì)照品溶液各30μL進(jìn)樣分析,以8 種生物胺質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo),各生物胺的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,考察各生物胺的線性關(guān)系。取上述衍生后的混合對(duì)照品溶液用甲醇適當(dāng)稀釋?zhuān)孕旁氡萐/N=10 和S/N=3 分別作為定量限和檢測(cè)限。

    2.1.5 回收率 取批號(hào)為220190106 的供試品溶液0.25 mL,共制9 份,分成3 組。分別精密加入1.00、5.00、10.00 μg/mL 混合對(duì)照品溶液0.25 mL,每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3 份,分別衍生后進(jìn)樣分析。

    2.1.6 精密度 取混合對(duì)照品溶液(10 μg/mL)0.5 mL進(jìn)行衍生反應(yīng),平行制備6份,進(jìn)樣分析。

    2.1.7 樣品測(cè)定 取3 個(gè)廠家的樣品按照“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液及對(duì)照品溶液并分別進(jìn)行衍生反應(yīng),按照“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算各生物胺的含量。

    2.2 黃曲霉毒素的測(cè)定

    按照《中華人民共和國(guó)藥典》(2015 年版)四部通則2351黃曲霉毒素測(cè)定法指導(dǎo)原則及相關(guān)的文獻(xiàn)[3-4],建立了鹿瓜多肽注射劑及中間提取液中黃曲霉毒素的HPLC 柱后光化學(xué)衍生測(cè)定方法。采用Phenomenex Luna C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),熒光檢測(cè)器(激發(fā)波長(zhǎng)360 nm,發(fā)射波長(zhǎng)450 nm),以甲醇-乙腈-水(30∶15∶55)為流動(dòng)相,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量50μL。將適宜濃度的黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液、鹿瓜多肽注射劑樣品溶液及中間提取液分別通過(guò)免疫親和柱,流速為每秒1~2滴,用水20 mL 洗脫,棄去洗脫液,使空氣進(jìn)入柱子,最后用甲醇洗脫并進(jìn)樣分析。

    2.3 甜瓜子原料酸價(jià)及過(guò)氧化值的測(cè)定

    參考食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品中酸價(jià)的測(cè)定(GB 5009.229-2016)》及《食品中過(guò)氧化值的測(cè)定(GB 5009.227-2016)》,對(duì)甜瓜子原料(A 企業(yè)3 批,B 企業(yè)5 批)的酸價(jià)、過(guò)氧化值進(jìn)行檢測(cè)。首先將甜瓜子粉碎,用水?dāng)噭虿⒔?~3 h;再加入石油醚,浸泡過(guò)夜;經(jīng)裝有無(wú)水硫酸鈉的濾紙過(guò)濾,取濾液置圓底燒瓶中,在40 ℃水浴中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干石油醚,殘留物即為待測(cè)油脂;用滴定法測(cè)定待測(cè)油脂的酸價(jià)和過(guò)氧化值。酸價(jià)測(cè)定采用乙醇制氫氧化鉀滴定液(0.1 mol/L)進(jìn)行電位滴定;過(guò)氧化值測(cè)定采用硫代硫酸鈉滴定液(0.002 mol/L)進(jìn)行電位滴定。

    2.4 高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)

    參考相關(guān)文獻(xiàn)[5-6],進(jìn)行條件優(yōu)化后采用Tricine-SDS-PAGE 電泳法測(cè)定鹿瓜多肽注射劑的高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)。優(yōu)化后的電泳條件為:16.5%的分離膠,10%的積層膠,4%的濃縮膠;陽(yáng)極緩沖液為T(mén)ris-HCl緩沖液(pH 8.9),陰極緩沖液為T(mén)ris-Tricine-SDS 緩沖液;染色液為甲醇-冰醋酸-水(200∶50∶250)、含0.2%考馬斯亮藍(lán)R-250;脫色液為0.5 mol/L 氯化鈉溶液。實(shí)驗(yàn)時(shí)先用Tricine-SDS-PAGE 分離供試品溶液中的多肽成分,然后用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色,對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量大于5 800的高相對(duì)分子質(zhì)量蛋白進(jìn)行定量。精密稱(chēng)取核糖核酸酶A 適量,加水溶解并稀釋制成含核糖核酸酶A 800,600,400,200,100 μg/mL 的系列溶液,作為蛋白對(duì)照品溶液1~5。以蛋白對(duì)照品溶液1~5 的蛋白含量為橫坐標(biāo),灰度值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得出線性方程。根據(jù)供試品溶液中蛋白條帶的灰度值計(jì)算出供試品中高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)的含量。

    2.5 溶血與凝聚

    取家兔耳動(dòng)脈血,按《中華人民共和國(guó)藥典》(2015 年版)四部通則1148 溶血與凝聚檢查法制備2%紅細(xì)胞懸液,69 批鹿瓜多肽注射劑均按照2 mg/mL 多肽含量制備供試品溶液,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組(氯化鈉注射液)和陽(yáng)性對(duì)照組(滅菌注射用水)。采用直接觀察法(試管內(nèi)肉眼觀察)考察受試物管中的溶液在3 h 內(nèi)是否發(fā)生溶血和凝聚反應(yīng),直接觀察法結(jié)束后,將供試品和對(duì)照組均以2 000 r/min 離心5 min,用酶標(biāo)儀測(cè)定上清液在545 nm波長(zhǎng)處的吸收度。每管加樣3個(gè)復(fù)孔,求其平均值。按公式[溶血率=(供試品管吸收度-陰性對(duì)照管吸收度)/(陽(yáng)性對(duì)照管吸收度-陰性對(duì)照管吸收度)×100%]計(jì)算溶血率,以溶血率大于5%表示有溶血發(fā)生。

    2.6 多肽含量測(cè)定

    多肽含量測(cè)定試劑盒基于《中華人民共和國(guó)藥典》(2015 年版)四部通則0731 蛋白質(zhì)含量測(cè)定第四法(BCA 法)測(cè)定原理,對(duì)照品貯備液為牛血清白蛋白溶液,用水配制成下列質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液:500、250、125、62.5、31.25、15.625 和0μg/mL,按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)操作并用酶標(biāo)儀在480 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度,同時(shí)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。鹿瓜多肽注射劑用水溶解并稀釋制成250 μg/mL(以多肽計(jì))的溶液,作為供試品溶液。將供試品溶液的平均吸收度代入上述對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線中,計(jì)算出供試品溶液的多肽含量。

    2.7 生物學(xué)活性測(cè)定

    針對(duì)鹿瓜多肽注射劑的抗炎作用,并參考相關(guān)文獻(xiàn)[7-8],采用CCK-8 法考察鹿瓜多肽注射劑抑制THP-1 細(xì)胞增殖的作用,以此評(píng)價(jià)其生物學(xué)活性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的THP-1 細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度,以每孔0.1 mL 接種于96 孔板,在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h,然后以每孔0.1 mL 加入不同質(zhì)量濃度的鹿瓜多肽注射劑受試物溶液,每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔,同時(shí)制備陰性對(duì)照組(不加受試物溶液,加入同體積的培養(yǎng)基)和空白組(不加細(xì)胞孔)。在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h。終止培養(yǎng)前4 h,每孔加入CCK-8 溶液10μL,作用4 h 后,用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度,按公式[抑制率=(陰性對(duì)照組平均吸收度-空白吸收度)/(受試物組平均吸收度-空白吸收度)×100%]計(jì)算抑制率,以此評(píng)價(jià)鹿瓜多肽注射劑對(duì)THP-1 細(xì)胞的增殖抑制作用。

    3 結(jié) 果

    3.1 生物胺的測(cè)定

    3.1.1 系統(tǒng)適用性和專(zhuān)屬性 取空白溶劑、混合對(duì)照品溶液(10μg/mL)和供試品溶液分別衍生后進(jìn)樣分析。結(jié)果表明,該方法專(zhuān)屬性良好,空白溶劑在目標(biāo)峰出峰位置無(wú)干擾,各生物胺色譜峰理論塔板數(shù)均大于10 000,各相鄰峰的分離度均大于1.5,色譜圖見(jiàn)圖1。

    Figure 1 HPLC chromatogram of blank solution(A),reference solution(B)and sample test solution(C)of Cervus and Cucumis polypeptide injection

    3.1.2 線性關(guān)系、定量限及檢測(cè)限考察 8 種生物胺均在0.10~50.00 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;各生物胺的定量限在0.031~0.112 μg/mL 之間;檢測(cè)限在0.009~0.034 μg/mL 之間,結(jié)果見(jiàn)表1。

    3.1.3 回收率試驗(yàn) 結(jié)果顯示8種生物胺的平均回收率在90.71%~97.88%之間,RSD在0.55%~2.04%之間,均符合《中華人民共和國(guó)藥典》要求,結(jié)果見(jiàn)表1。

    3.1.4 精密度試驗(yàn) 結(jié)果組胺、色胺、2-苯乙胺、腐胺、酪胺、尸胺、亞精胺、精胺8 種生物胺的衍生物峰面積RSD(n=6,%)分別為0.73、0.21、0.47、0.47、1.01、1.32、0.23、0.81,表明色譜系統(tǒng)精密度良好。

    3.1.5 樣品檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果顯示,A 企業(yè)和C 企業(yè)的鹿瓜多肽注射劑檢出組胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺等生物胺,但含量均較低(0.004%~0.038%,占多肽標(biāo)示量的百分比計(jì));而B(niǎo) 企業(yè)的10 批鹿瓜多肽注射劑均檢出較高濃度的尸胺,范圍從0.265%~0.333%。各樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

    Table 1 Results of methodological validation tests for the content determination of biogenic amines

    Table 2 Concentration of biogenic amines in 22 batches samples of Cervus and Cucumis polypeptide injection

    3.2 黃曲霉毒素的測(cè)定

    選取3 個(gè)企業(yè)共30 批鹿瓜多肽注射劑和8 批甜瓜子提取液進(jìn)行了黃曲霉毒素的測(cè)定,結(jié)果上述38 批樣品均未檢出黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2(黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的檢測(cè)限分別為0.012、0.003 4、0.011、0.003 6 ng/mL)。

    3.3 甜瓜子原料酸價(jià)及過(guò)氧化值的測(cè)定

    通過(guò)對(duì)兩個(gè)企業(yè)共8批甜瓜子原料進(jìn)行測(cè)定,過(guò)氧化值測(cè)定結(jié)果在0.004~0.014 g/100 g 之間,低于國(guó)標(biāo)GB 19300-2014 的限值0.40 g/100 g。而酸價(jià)結(jié)果差異較大,在1.92~7.26 mg/g 之間(以KOH 計(jì)),其中A 企業(yè)批號(hào)為20180901 的甜瓜子原料酸價(jià)為7.26 mg/g,B 企業(yè)批號(hào)為1901002和1902003 的甜瓜子原料酸價(jià)分別為3.14 和3.06 mg/g,均超過(guò)國(guó)標(biāo)GB 19300-2014 的限值3.0 mg/g。

    3.4 高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)的考察

    凝膠色譜法測(cè)定高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)操作簡(jiǎn)便,但對(duì)于成分復(fù)雜的多組分生化藥并不適用。鹿瓜多肽注射劑色譜流出峰難以有效分離,對(duì)積分和定量都造成一定困難(圖2),導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。

    Figure 2 SEC-HPLC chromatogram of reference substance (A, relative molecular weight 5 800) and test sample (B, batch No. 181018) of Cervus and Cucumis polypeptide injection

    為了尋找比凝膠色譜法更準(zhǔn)確的測(cè)定方法,探索性研究嘗試了Tricine-SDS-PAGE 電泳(圖3)。因A 企業(yè)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中暫無(wú)高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)檢查項(xiàng),故隨機(jī)抽取A 企業(yè)的10 批樣品進(jìn)行高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)的測(cè)定,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。以對(duì)照品溶液1~5 的蛋白含量為橫坐標(biāo),以掃描灰度值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,相關(guān)系數(shù)r值均大于0.98;10 批鹿瓜多肽注射劑樣品高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)含量平均值為16.36%。另經(jīng)測(cè)定,B、C 企業(yè)的高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)含量均低于2.0%。綜上,提示A企業(yè)應(yīng)進(jìn)一步改進(jìn)超濾工藝,降低高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)的含量,從而提高產(chǎn)品的安全性。

    Figure 3 Tricine-SDS-PAGE gel electrophotogram of high molecular weight substance of Cervus and Cucumis Polypeptide Injection (batch No. 181018)

    Table 3 Results of high molecular weight substance of Cervus and Cucumis polypeptide injection by Tricine-SDS-PAGE

    3.5 溶血與凝聚測(cè)定

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,所有批次供試品溶液和陰性對(duì)照管均無(wú)溶血與凝聚現(xiàn)象;經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)定并計(jì)算溶血率,結(jié)果所有供試品溶液溶血率均在5%以下,表明本品無(wú)體外溶血作用。

    3.6 多肽含量測(cè)定

    試劑盒法測(cè)定多肽含量的方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示,多肽在15.63~1 000 μg/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸收度呈良好的線性關(guān)系;平均加樣回收率為99.4%,RSD 為3.0%(n=9);最低檢測(cè)限為15.63μg/mL。

    按法定標(biāo)準(zhǔn)福林酚法檢驗(yàn)全部69 批次樣品,結(jié)果多肽含量合格率為100%。但由于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)只規(guī)定了含量測(cè)定值的下限而未設(shè)定上限,不符合藥品質(zhì)量控制要求。擬將含量限度統(tǒng)一修訂為“含多肽以牛血清白蛋白計(jì),應(yīng)為標(biāo)示量的80%~120%”。按照修訂后的限度規(guī)定,用福林酚法和試劑盒法測(cè)定69 批樣品的合格率分別為84.1%和81.2%,其中不合格樣品均是含量超上限(圖4)。

    Figure 4 Results of peptide content determination of Cervus and Cucumis polypeptide injection

    3.7 生物學(xué)活性測(cè)定

    3.7.1 方法的建立 配制質(zhì)量濃度為0.125,0.25,0.5,1,2,4 mg/mL 的鹿瓜多肽注射劑受試物溶液,與THP-1 細(xì)胞共同孵育24、48、72 h 后測(cè)定吸收度。結(jié)果顯示,同濃度下受試物溶液隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),對(duì)THP-1 細(xì)胞的抑制作用逐漸增大;在同一作用時(shí)間下,隨著受試物溶液濃度的增加,對(duì)THP-1 細(xì)胞的抑制作用亦逐漸增大。鹿瓜多肽注射劑受試物均表現(xiàn)出明顯的量效和時(shí)效關(guān)系,最終選用質(zhì)量濃度為2 mg/mL、作用時(shí)間為72 h 對(duì)隨機(jī)24 批樣品的細(xì)胞增殖抑制效果進(jìn)行比較。

    3.7.2 樣品測(cè)定結(jié)果 經(jīng)探索性研究,在本實(shí)驗(yàn)條件下,A 企業(yè)樣品的抑制指數(shù)為9.6~16.8,批次之間最大差異為4.5%;B 企業(yè)樣品的抑制指數(shù)為2.4~3.4,批次之間最大差異為11.6%;C 企業(yè)樣品的抑制指數(shù)為1.4~1.9,批次之間最大差異為17.7%。3 個(gè)企業(yè)樣品在相同條件下,體外抗炎效果有一定的差異。A 企業(yè)鹿瓜多肽注射劑對(duì)THP-1 細(xì)胞的抑制作用明顯優(yōu)于B、C企業(yè)。

    4 討 論

    4.1 與安全性相關(guān)的檢測(cè)項(xiàng)目

    4.1.1 生物胺 B 企業(yè)鹿瓜多肽注射劑中檢出高濃度的尸胺,經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[9-11],尸胺具有致突變性,其致癌性證據(jù)尚不充分。參考人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)M7 及歐洲藥物管理局(EMEA)發(fā)布的《遺傳毒性雜質(zhì)限度指導(dǎo)原則》相關(guān)規(guī)定,尸胺的含量限度可以參照2類(lèi)遺傳毒性雜質(zhì)(致癌性未知的已知致突變性物質(zhì))來(lái)控制。按照毒理學(xué)關(guān)注閾值(TTC)作為評(píng)價(jià)2 類(lèi)遺傳毒性雜質(zhì)的限度要求,經(jīng)計(jì)算得知,鹿瓜多肽注射劑中含尸胺不得過(guò)0.04%[12-13]。因此,B 企業(yè)的鹿瓜多肽注射劑中尸胺含量均超過(guò)限度,提示該類(lèi)動(dòng)植物來(lái)源的多組分生化藥在原料及中間提取液的新鮮度方面應(yīng)給予重視。

    4.1.2 其他安全性相關(guān)指標(biāo) 經(jīng)測(cè)定,鹿瓜多肽成品制劑及中間提取液中均未檢出黃曲霉毒素殘留,說(shuō)明終產(chǎn)品尚不存在黃曲霉毒素污染的風(fēng)險(xiǎn)。但現(xiàn)場(chǎng)調(diào)研時(shí)發(fā)現(xiàn)甜瓜子的霉變現(xiàn)象,可能在提取純化工藝中黃曲霉毒素被去除,或是霉變情況可能來(lái)源于其他真菌污染,如赭曲霉、青霉、鐮刀霉等,因現(xiàn)場(chǎng)調(diào)研時(shí)未能及時(shí)留樣,無(wú)從考證霉變的來(lái)源,未來(lái)將繼續(xù)篩查其他真菌毒素的污染情況,進(jìn)一步提升本品的安全性。

    3 家生產(chǎn)企業(yè)都有固定的甜瓜子供應(yīng)商,并對(duì)甜瓜子進(jìn)行自檢,但其內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)均未對(duì)酸價(jià)及過(guò)氧化值有要求。酸價(jià)和過(guò)氧化值在一定程度上可體現(xiàn)甜瓜子的新鮮程度[14-15],因此有必要限量控制。甜瓜子屬于易蟲(chóng)蛀、霉變、酸敗的原料,放置溫度、濕度等都會(huì)對(duì)其品質(zhì)有所影響。調(diào)研結(jié)果顯示個(gè)別企業(yè)會(huì)一次性購(gòu)入大量同一批次的甜瓜子原料以備庫(kù)存,但是隨著時(shí)間的延長(zhǎng),甜瓜子發(fā)生酸敗的概率也會(huì)隨之加大。因此,建議生產(chǎn)企業(yè)加強(qiáng)對(duì)甜瓜子原料的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)制訂,增加真菌毒素、酸價(jià)和過(guò)氧化值檢查項(xiàng),并關(guān)注儲(chǔ)存條件與期限是否會(huì)對(duì)甜瓜子的品質(zhì)造成影響。

    4.2 與有效性相關(guān)的檢測(cè)項(xiàng)目

    4.2.1 多肽含量測(cè)定 鹿瓜多肽注射劑現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)均采用福林酚法測(cè)定多肽含量,對(duì)該法產(chǎn)生干擾的物質(zhì)較多,輔料右旋糖酐40 和甘露醇在測(cè)定時(shí)均產(chǎn)生一定吸收度,導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確[16]。而經(jīng)試劑盒法測(cè)定,輔料甘露醇對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響;右旋糖酐40 會(huì)產(chǎn)生輕微干擾,導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏高。因此,無(wú)論是福林酚法還是試劑盒法,在計(jì)算含量時(shí)均應(yīng)扣除輔料對(duì)結(jié)果的貢獻(xiàn),而試劑盒法相對(duì)于福林酚法干擾物質(zhì)較少,重復(fù)性、專(zhuān)屬性更強(qiáng)。此外,由于試劑盒法無(wú)需配制反應(yīng)試劑,且比福林酚法操作步驟少,同時(shí)采用96 孔板并通過(guò)酶標(biāo)儀實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè),尤其適用于大批量樣品的快速測(cè)定。

    4.2.2 生物學(xué)活性 臨床上,多組分生化藥起作用多為若干種機(jī)制協(xié)同作用的結(jié)果。鹿瓜多肽注射劑的作用機(jī)制主要包括促骨細(xì)胞增殖和抗炎活性?xún)煞矫?,有研究?bào)道了基于骨細(xì)胞株的鹿瓜多肽注射劑體外活性的測(cè)定方法,該法選用大鼠骨肉瘤UMR106細(xì)胞株,考察樣品對(duì)細(xì)胞的增殖刺激作用,針對(duì)鹿瓜多肽注射劑促骨細(xì)胞增殖的作用機(jī)制來(lái)建立細(xì)胞試驗(yàn)?zāi)P停?7]。而本研究建立的方法選用單核巨噬細(xì)胞THP-1 作為試驗(yàn)?zāi)P?,考察樣品?duì)細(xì)胞的增殖抑制作用,針對(duì)其抗炎活性用于評(píng)價(jià)生物學(xué)活性,與其治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床適應(yīng)證一致,因此可以更為直觀地反映出藥品的效應(yīng)及質(zhì)量,且抑制作用明顯,操作簡(jiǎn)便,為該類(lèi)產(chǎn)品質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    5 總 結(jié)

    本研究從生物胺的含量、黃曲霉毒素測(cè)定以及甜瓜子原料的酸價(jià)、過(guò)氧化值的考察等多角度評(píng)價(jià)了鹿瓜多肽注射劑的新鮮度,并改進(jìn)了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)和多肽含量測(cè)定的方法,同時(shí)對(duì)建議增訂項(xiàng)目溶血與凝聚、生物學(xué)活性的測(cè)定做了初步探索。通過(guò)上述工作,可以為鹿瓜多肽注射劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供理論依據(jù),并為該類(lèi)多組分生化藥安全性的提升奠定基礎(chǔ)。

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