抗敏顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究

王璐 黃魯 汪玥

摘要 目的：提升抗敏顆粒制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：利用薄層色譜法（TLC）對抗敏顆粒中苦參、地膚子、甘草、赤芍4種組分進(jìn)行定性鑒別，運用高效液相色譜法（HPLC）測定制劑中苦參堿的含量。色譜條件：Agilent NH2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相條件：乙腈-無水乙醇-3%磷酸（80∶ 10∶ 10），利用220 nm波長進(jìn)行檢測，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：建立的苦參、地膚子、甘草、赤芍的TLC鑒別中，成分斑點清晰，分離度好，且陰性對照樣品無干擾?？鄥A質(zhì)量濃度在11.31～180.96 μg/mL范圍內(nèi)，與峰面積線性關(guān)系良好，R2=1;平均加樣回收率為100.88%，RSD為2.31%（n=9）。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確易行，精密度、穩(wěn)定、重復(fù)性均較好，可用作抗敏顆粒制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞 抗敏顆粒;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);薄層色譜;高效液相色譜;苦參堿;苦參;地膚子;甘草;赤芍

Abstract Objective：To improve the quality standard of Kangmin Granules.Methods：Sophora flavescens，F(xiàn)ructus Kochiae Scoparuae，Radix Grycyrrhizae and Radix Paeoniae Rubra were identified by thin-layer chromatography（TLC）.The content of matrine in the preparation was determined by high performance liquid chromatography（HPLC）.Chromatographic conditions：Agilent NH2 column（4.6 mm×250 mm，5 μm），mobile phase conditions：acetonitrile-anhydrous ethanol-3% phosphoric acid（80∶ 10∶ 10），detection at 220 nm wavelength，flow rate 1.0 mL/ min，column temperature 25 ℃，injection volume 10 L.Results：In the established TLC identification of Sophora flavescens，Radix Rhizoma，Radix Glycyrrhizae，and Radix Paeoniae Alba，the component spots were clear，the separation was good，and the negative control sample had no interference.The concentration of Sophora flavescens was in the range of 11.31～180.96 μg/mL，which has a good linear relationship with the peak area，R2=1; the average sample recovery rate was 100.88%，and the RSD was 2.31%（n=9）.Conclusion：The method is accurate and easy to perform，with good precision，stability and repeatability，and can be used as a quality standard for Kangmin Granules.

Keywords Kangmin Granules; Quality standard; TLC; HPLC; Matrine; Sophora Flavescens; Fructus kochiae scoparuae; Radix grycyrrhizae; Radix paeoniae rubra

中圖分類號：R284 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.16.002

抗敏顆粒為東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院的特色制劑之一，由苦參、牡丹皮、地膚子、蛇床子、僵蠶等11味中藥制成，具有祛風(fēng)除濕，清熱涼血的功效。臨床上主要用于皮膚過敏性疾病的治療。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅對君藥苦參、佐使藥地膚子與甘草運用薄層色譜法（TLC）進(jìn)行定性鑒別，卻沒有主要成分的含量測定。因此，為了進(jìn)一步加強對抗敏顆粒的質(zhì)量控制，提升其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證該制劑臨床用藥的安全有效性[1]，本研究對地膚子的鑒別方法進(jìn)行了修訂，并增加了佐藥赤芍的薄層鑒別項。該制劑中的君藥為苦參，具有清熱燥濕、殺蟲利尿的功效，臨床多用于濕疹、皮膚瘙癢等癥[2]。其中苦參堿是苦參中的主要藥效成分，具有抗炎、抗腫瘤、免疫抑制等多種藥理作用[3-4]。因此，本研究將苦參堿作為指標(biāo)成分并建立高效液相色譜法（HPLC）對其含量進(jìn)行測定，完善抗敏顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（VWD檢測器，安捷倫科技有限公司，型號：Agilent1100），電子天平（METTLER TOLEDO儀器有限公司，型號：AE240），電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司，型號：FA1604S），恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司，型號：HH6），臺式數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ-100DE）。

1.2 試劑 地膚子對照藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號：121148-200803）;甘草對照藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號：120904-201418）;赤芍對照藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號：121093-201403）以及苦參堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110805-200706）;乙腈（色譜純，TEDIA），薄層層析硅膠板G型（青島海洋化工），中性氧化鋁柱（Sepax Extraction Columns，5 g，25 mL，20 kg）

1.3 分析樣品 抗敏顆粒樣品（東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科制劑室生產(chǎn)，批號：160329，161109，170227，170728，171013，180413）。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別 苦參：取本品20 g，研碎，加濃氨水適量濕潤，放置1 h，加入二氯甲烷100 mL，經(jīng)過超聲提取處理30 min，濾過，蒸干濾液，殘渣中加入1 mL甲醇，取上清，用作供試品溶液。向苦參堿對照品中加入甲醇，制成苦參堿含量為0.52 mg/mL的溶液，用作對照品溶液。另外，根據(jù)處方比例稱取除苦參外的其他藥材，制成陰性對照溶液。將上述3種溶液各吸取20 μL，點在同一硅膠G板上，用二氯甲烷-甲醇-濃氨水（5∶ 0.6∶ 0.2）作為展開劑，展開，取出，晾干，然后噴以改良的碘化鉍鉀試液。供試品在和對照品相應(yīng)位置的色譜顯現(xiàn)出同樣顏色的斑點，同時，陰性對照色譜沒有斑點，說明該方法可行。結(jié)果見圖1A。

地膚子：取本品30 g，研碎，加入70 mL乙醇，鹽酸1.5 mL，加熱回流2 h，濾過，濾液濃縮到約5 mL，加水10 mL于分液漏斗，加入石油醚（60～90 ℃）萃取2次，20 mL/次，與石油醚液合并后蒸干，向殘渣中加入1 mL乙醇作為供試品溶液。另外，取地膚子藥材0.5 g對照，加50 mL乙醇，1 mL鹽酸，同上述制備方法制成對照藥材溶液。另按處方比例稱取地膚子、車前草以外的藥材，制成陰性對照藥材溶液[5]。將供試品溶液和陰性對照溶液各取20 μL，對照品溶液取10 μL，點在同一硅膠G薄層板上，用二氯甲烷-甲醇（20∶ 1）作為展開劑，展開，取出，晾干，然后噴5%的磷鉬酸試液，105 ℃烘數(shù)分鐘。供試品在和對照品相應(yīng)位置的色譜顯現(xiàn)出同樣顏色的斑點，同時，陰性對照溶譜無斑點，說明該方法可行。結(jié)果見圖1B。

甘草：取本品30 g，研碎，加入乙醇70 mL，加熱回流提取2次，1 h/次，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加水30 mL，鹽酸1 mL，1，2-二氯乙烷30 mL，繼續(xù)加熱回流2 h，分出1，2-二氯乙烷層。酸水層再用1，2-二氯乙烷振搖提取2次，15 mL/次，酸水層留用。將兩次提取液混合，水浴蒸干，將剩余殘渣加入1 mL甲醇，作為供試品溶液。另取甘草藥材0.5 g，研碎，依次加水50 mL、鹽酸0.5 mL、1，2-二氯乙烷15 mL，加熱回流2 h，濾過，分取1，2-二氯乙烷層，水浴蒸干，將殘渣加入1 mL甲醇溶解，作為對照藥材溶液。另稱取甘草以外的藥材，制成陰性對照溶液。上述溶液各吸取20 μL，點在同一硅膠G薄層板上，用正己烷-丙酮-乙酸乙酯（5∶ 2∶ 1）作為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%的硫酸乙醇溶液，然后在105 ℃條件下烘約5 min至斑點顯色清晰。供試品在和對照品相應(yīng)位置的色譜顯現(xiàn)出同樣顏色的斑點，同時，陰性對照色譜無斑點，說明該方法可行。結(jié)果見圖1C。

赤芍：取本品30 g，研碎，加乙醇100 mL回流提取2 h，濾過，濾液水浴蒸干，將殘渣加入30 mL水溶解，進(jìn)行2次乙醚振搖提取，15 mL/次，再用正丁醇振搖提取水層2次，20 mL/次，將提取液混合后用水洗滌2次，20 mL/次，收集正丁醇提取液，水浴蒸干，加入1 mL甲醇作為供試品溶液。取赤芍對照藥材0.5 g，加入乙醇50 mL，制成對照藥材溶液。另按處方比例稱取赤芍和牡丹皮以外的藥材，研細(xì)，按照抗敏顆粒的生產(chǎn)工藝以及上述制備方法制成陰性對照溶液。將上述3種溶液各吸取5 μL，點在同一硅膠G薄層板上，三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水（8∶ 1∶ 4∶ 2）的下層溶液作為展開劑，展開，取出，晾干，噴5%香草醛硫酸溶液，然后在105 ℃條件下烘至斑點顯色清晰。供試品在和對照品相應(yīng)位置的色譜顯現(xiàn)出同樣顏色的斑點，同時，陰性對照色譜無斑點，說明該方法可行。結(jié)果見圖1D。

2.2 苦參堿含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：氨基鍵合硅膠柱;流動相：乙腈-無水乙醇-3%磷酸（80∶ 10∶ 10）[6];柱溫：25 ℃;流速：1.0 mL/min;進(jìn)樣量：10 μL;檢測波長：220 nm;理論塔板數(shù)不小于2 000[7]。

2.2.2 對照品溶液的制備 向適量苦參堿對照品加入乙腈-無水乙醇（80∶ 20）制成每1 mL對照品溶液約含苦參堿0.050 mg。

2.2.3 供試品溶液的制備 取適量本品，研細(xì)，精密稱取約2.0 g，置于50 mL平底燒瓶中，精密加入氨水2 mL[8]、三氯甲烷20 mL，稱定重量，65 ℃水浴回流2 h，放冷，然后加入三氯甲烷補足減重，并搖勻，過濾，精密吸取續(xù)濾液5 mL，過中性氧化鋁柱（Sepax Extraction Columns，5 g，25 mL，20 kg），依次用三氯甲烷50 mL，三氯甲烷-甲醇（7∶ 3）50 mL沖洗，收集洗液，水浴蒸干，用無水乙醇溶解并定容至5 mL，用作供試品。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 制備不含苦參的陰性對照樣品，然后制成陰性對照樣品溶液[9]。

2.2.5 專屬性試驗 將供試品溶液、對照品溶液和陰性對照樣品溶液各取10 μL，按“2.2.1”中的條件進(jìn)樣，結(jié)果表明，陰性對照溶液色譜圖中相應(yīng)位置無色譜峰，說明除了苦參的其他藥材對苦參堿的測定無干擾。結(jié)果見圖2。

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密稱取苦參堿對照品11.31 mg，置于50 mL量瓶中，加乙腈-無水乙醇（80∶ 20）溶解，稀釋，搖勻，作儲備液。分別吸取對照品苦參堿儲備液0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 mL至10 mL容量瓶中，用乙腈-無水乙醇（80∶ 20）稀釋至刻度，按“2.2.1”項下的色譜條件進(jìn)樣，得線性回歸得方程為：Y=7.997X+0.515 8，R2=1（n=5），其中，X為苦參堿對照品溶液濃度，Y為峰面積。結(jié)果表明苦參堿的濃度在11.31～180.96 μg/mL之間，與峰面積呈良好的線性相關(guān)。見表1，圖3。

2.2.7 精密度試驗 取苦參堿對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。計算峰面積RSD為0.75%，結(jié)果證明該方法精密性較好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（批號：170227），常溫下分別于0、1、2、4、8 h，按“2.2.1”項下的色譜條件進(jìn)樣，并記錄峰面積。經(jīng)計算，峰面積RSD為1.62%，結(jié)果證明供試品在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗 取同一批號下（批號：170227）的抗敏顆粒，制備5份供試品溶液，測得苦參堿的平均含量為552.563 μg/g，RSD為4.71%，結(jié)果證明此方法的重復(fù)性較好。

2.2.10 加樣回收率試驗 稱取9份已知含量的樣品（批號：170227），約1.0 g/份，分別置于圓底燒瓶中，按低、中、高3個濃度分別精密加入苦參堿儲備液0.7 mL、1.2 mL、1.6 mL，制備供試品溶液。進(jìn)樣結(jié)果見表2。

2.2.11 樣品測定結(jié)果 取3個批次（170728，171013，180413）抗敏顆粒，按照擬定色譜條件進(jìn)樣，對每個批次的抗敏顆粒進(jìn)行3次平行測定，根據(jù)記錄的苦參堿峰面積計算其含量。結(jié)果見表3。

3 討論

地膚子鑒別項中，在對原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中地膚子鑒別項進(jìn)行驗證時發(fā)現(xiàn)，有明顯陰性干擾，可能是在1，2-二氯乙烷萃取時，一些大極性的、與齊墩果酸結(jié)構(gòu)相似的成分也被萃取出來導(dǎo)致的?，F(xiàn)對其提取方法做了改進(jìn)，將1，2-二氯乙烷萃取改為石油醚萃取，排除了原有大極性成分的干擾。另地膚子與車前草均含有齊墩果酸成分，故在提取陰性對照溶液時采用“雙陰性”法同時去除地膚子和車前草藥材，以保證試驗有效性[10]。

赤芍鑒別項中，赤芍、牡丹皮共同含有以下化學(xué)成分：芍藥苷、牡丹酚苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷及牡丹酚，且二者同為毛茛科植物[11-12]，故在提取陰性對照溶液時采用“雙陰性”法同時除去赤芍和牡丹皮藥材，確保試驗有效。

苦參堿含量測定項中，在樣品中加入足量的氨水（2 mL）堿化，可以增強生物堿的脂溶性，利于生物堿游離出來，便于分離提純[13]。在制劑的提取過程中，曾嘗試萃取[14-15]、超聲、回流3種方法。結(jié)果顯示，用三氯甲烷（20、15、10 mL）萃取3次后，仍有許多與三氯甲烷極性相近的雜質(zhì)無法去除，導(dǎo)致進(jìn)樣后苦參堿峰峰形差，而回流的提取效率明顯高于超聲，且峰形較好，故最終選擇回流2 h作為提取方法。

在分離提純過程中，筆者曾采用中性氧化鋁（上海陸都化學(xué)試劑廠）裝柱（10 g，內(nèi)徑1.5 cm）后用三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇（7∶ 3）50 mL沖洗，但分離效果較差。后外購裝填好的中性氧化鋁預(yù)柱（Sepax Extraction Columns，5 g，25 mL，20 kg），相同提取方法下分離效果較好。這可能是由于手工裝柱時，中性氧化鋁裝填松散，間隙較大，所需成分部分殘留在中性氧化鋁間隙中無法被洗脫。而外購針管式預(yù)柱裝填緊密且配有隔板保護(hù)樣品，因此分離效果較好[16]。

在確定沖洗中性氧化鋁柱的溶液體積時，課題組曾嘗試依次使用三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇（7∶ 3）20 mL結(jié)果沖洗不完全，導(dǎo)致苦參堿含量測定的重復(fù)性較差。之后分別使用25 mL、50 mL、100 mL沖洗，發(fā)現(xiàn)50 mL即能沖洗完全。最終確定沖洗液體積為50 mL。

原藥典方法中，苦參藥材的含量測定需同時測定苦參堿及氧化苦參堿，但由于氧化苦參堿耐高溫性較差[17-18]，在制劑生產(chǎn)的高溫干燥過程中損失較大，考慮到正文方法的檢測限，最終只選用了苦參堿作為含量檢測指標(biāo)。

綜上所述，本研究對抗敏顆粒原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中TLC鑒別項進(jìn)行了修訂和完善，建立了新的苦參堿含量的測定方法。該研究中建立的方法專屬性強，重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性均較好，且操作簡便，可用于抗敏顆粒的質(zhì)量控制。

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（2019-05-30收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）