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    基于QuEChERS液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中除蟲脲殘留量的不確定度評定

    2020-09-11 08:38:08覃慧麗
    現(xiàn)代農(nóng)藥 2020年4期
    關(guān)鍵詞:除蟲工作液殘留量

    武 源,覃慧麗

    除蟲脲又名敵滅靈,是一種苯甲酰胺類殺蟲劑,具有對人畜低毒、對環(huán)境無公害等特點(diǎn),其已被廣泛用于茶園害蟲的防治[1-5]。茶葉產(chǎn)業(yè)關(guān)乎我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村發(fā)展,茶葉質(zhì)量安全影響我國茶葉對外貿(mào)易,近年來,農(nóng)藥殘留已成為影響茶葉質(zhì)量安全的重要因素之一,除蟲脲及其降解產(chǎn)物殘留問題日益突出[6-8],嚴(yán)重影響到茶葉質(zhì)量安全。我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定茶葉中除蟲脲的最大殘留限量為20 mg/kg,日本和歐盟等進(jìn)口國家或地區(qū)均對茶葉制定了嚴(yán)格的農(nóng)藥殘留限量[9-10],日本規(guī)定除蟲脲在茶葉中最大殘留限量為20 mg/kg[11]。由于茶葉樣品基質(zhì)復(fù)雜,含有大量的生物堿、色素、咖啡因、茶多酚等干擾物質(zhì),使得農(nóng)殘檢測難度增大。為確保分析結(jié)果的準(zhǔn)確性,對檢測結(jié)果進(jìn)行不確定度評定是必要的,不確定度評定對于檢測過程的質(zhì)量把控具有重要意義[12]。

    目前除蟲脲在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法的不確定度判定研究基本空缺。本研究依據(jù)文獻(xiàn)[3-16],對測定茶葉中除蟲脲殘留量進(jìn)行了分析與評定,明確了QuEChERS液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中除蟲脲殘留量不確定的主要影響因素,為評價(jià)除蟲脲殘留量測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性提供技術(shù)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    提取試劑:4 g MgSO4,1 g NaCl,0.5 g三水合二檸檬酸二鈉,1 g檸檬酸鈉及兩顆陶瓷均質(zhì)子,美國Agilent公司;凈化試劑管:1 200 mg MgSO4,400 mg PSA,400 mg C18,200 mg GCB,美國Agilent公司。

    除蟲脲對照品(純度99.65%),德國Dr. Ehrenstorfe公司;三苯基磷酸酯對照品(TPP,純度99.6%),德國Dr.Ehrenstorfe公司;甲醇、乙腈(均為色譜純),德國Merck公司;甲酸、乙酸銨(均為色譜純),德國Fluka公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Xevo TQ-S 液 質(zhì) 聯(lián) 用 儀、ACQUITY UPLCBEH C18色譜柱(2.1×50 mm,1.7 μm),美國WATERS公司;XP26微量電子天平,瑞士Mettler Toledo公司;IKA VORTEX 4 basic渦旋振蕩器,德國IKA公司;TTL-DC Ⅱ型氮吹儀,北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司;SIGMA 3-3OK離心機(jī),德國SIGMA公司;Milli-Q超純水設(shè)備,美國Millipore公司。

    1.3 方法

    1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    陰性基質(zhì)溶液:稱取不含目標(biāo)物的茶葉按前處理步驟處理即得。

    除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)儲備液(500 μg/mL):精確稱取5 mg除蟲脲對照品于10 mL的容量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻線。

    TPP內(nèi)標(biāo)儲備液(500 μg/mL):精確稱取5 mg內(nèi)標(biāo)物對照品TPP于10 mL的容量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻線。

    除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)工作液(500 ng/mL):精確吸取0.02 mL的除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)儲備液于20 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻線。

    TPP內(nèi)標(biāo)工作液(5 μg/mL):精確吸取0.2 mL的內(nèi)標(biāo)儲備液于20 mL容量瓶中,用乙腈溶解定容至刻線。

    基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液:用移液槍分別精確移取0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mL的除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)工作液于10 mL的氮吹管中,加入0.01 mL內(nèi)標(biāo)工作液,氮吹近干,準(zhǔn)確加入1.0 mL陰性基質(zhì)溶液,渦旋復(fù)溶,即得基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液。以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中除蟲脲與內(nèi)標(biāo)TPP質(zhì)量濃度的比值(C除蟲脲/CTPP)為橫坐標(biāo),以除蟲脲與內(nèi)標(biāo)TPP定量離子峰面積的比值(A除蟲脲/ATPP)為縱坐標(biāo),繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.3.2 提取

    茶葉粉碎后進(jìn)一步充分混勻,準(zhǔn)確稱取2 g(精確至0.01 g)茶葉置于50 mL具塞離心管中,加10 mL水渦旋混勻,靜置30 min。離心管中加入0.10 mL TPP內(nèi)標(biāo)工作液,10 mL乙腈,加蓋渦旋振蕩30 s后加入提取試劑,立即劇烈振蕩1 min,防止結(jié)塊。以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min,待凈化。

    1.3.3 凈化

    取8 mL乙腈提取液轉(zhuǎn)移至15 mL凈化試劑管中,蓋緊離心管,充分渦旋振蕩1 min,以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心5 min,凈化液過0.22 μm濾膜后,取1 mL氮吹近干,加入1 mL水-甲醇(9∶1,V/V)渦旋混勻后上機(jī)分析。

    1.3.4 LC-MS/MS條件1.

    3.4.1 液相條件

    1.3.4.2 質(zhì)譜條件

    電噴霧離子源(ESI);多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)采集模式,正離子掃描。目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間、定量離子對和定性離子對見表1。

    表1 化合物保留時(shí)間及離子對

    1.4 數(shù)學(xué)模型的建立

    茶葉中目標(biāo)物殘留量X按公式(1)計(jì)算:

    式中:X為茶葉中除蟲脲的殘留量,mg/kg;C0為從基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的茶葉溶液中除蟲脲的質(zhì)量濃度,ng/mL;V為茶葉經(jīng)前處理后的稀釋體積,mL;m為稱取茶葉質(zhì)量,g。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)產(chǎn)生的不確定度μr(2.1)

    2.1.1 除蟲脲純度產(chǎn)生的不確定度μr(P)

    除蟲脲的純度為99.65%,查閱除蟲脲對照品標(biāo)準(zhǔn)證書,其不確定度U95為0.30%,在95%置信水平下,k=2,則標(biāo)準(zhǔn)不確定度μr(P)=0.15%,相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度μr(P)=0.001 5。

    2.1.2 除蟲脲稱量產(chǎn)生的不確定度μr(M)

    精密稱量除蟲脲對照品5.757 mg,用乙腈稀釋并定容至10 mL,得到除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)儲備液。微量電子分析天平校準(zhǔn)不確定度為主要分量,根據(jù)分析天平檢定證書,本試驗(yàn)所用天平的最大允許誤差為0.005 mg,按照均勻分布計(jì)算則除蟲脲標(biāo)不確定度μr(M)=0.002 9 mg,相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度μr(M)=0.000 5。

    2.1.3 配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)產(chǎn)生的不確定度μr(V)

    根據(jù)JJG196—2006《常用玻璃量器》[17]檢定規(guī)程的A級最大允許誤差(以下玻璃量器均按A級進(jìn)行評定)及廣西壯族自治區(qū)計(jì)量檢測研究院提供的實(shí)驗(yàn)室移液槍的檢定證書,按照式(2)計(jì)算量器容量允差產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度μr(V校準(zhǔn)):

    式中:a校準(zhǔn)為玻璃器具校準(zhǔn)引起的體積偏差;k取平均分布,即

    實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度波動(dòng)范圍為(20±5)℃,20℃乙腈的體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3℃-1,根據(jù)式(3)計(jì)算室溫波動(dòng)引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度μr(V溫度):

    式中:a溫度為實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度波動(dòng)帶來的溶劑體積偏差;k取平均分布,即

    分別移取0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mL的除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)工作液于10 mL的氮吹管中,加入0.01 mL內(nèi)標(biāo)工作液,氮吹近干,用移液槍準(zhǔn)確加入1 mL陰性基質(zhì)溶液,充分渦旋。實(shí)驗(yàn)中配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)移取和定容步驟,用到不同規(guī)格的移液槍和容量瓶,均按平均分布計(jì)算各分量合成配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)產(chǎn)生的不確定度μr(V)(表2)。

    基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋過程由上述19次移液,2次定容完成,配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)產(chǎn)生的不確定度μr(V)=0.021。

    表2 量器引入相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

    由此,稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)產(chǎn)生的不確定度μr(2.1):

    2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過程產(chǎn)生的不確定度μr(2.2)

    配制除蟲脲6個(gè)質(zhì)量濃度分別為5.734、11.47、28.67、57.34、114.7、286.7 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行重復(fù)測定3次。由于實(shí)驗(yàn)全程加入同一瓶內(nèi)標(biāo)使用液,內(nèi)標(biāo)濃度一致,無需考慮內(nèi)標(biāo)使用液濃度引入的不確定度,只需考慮內(nèi)標(biāo)使用體積引入的不確定度,為方便計(jì)算實(shí)驗(yàn)將內(nèi)標(biāo)TPP質(zhì)量濃度設(shè)為1 ng/mL。即除蟲脲與內(nèi)標(biāo)TPP質(zhì)量濃度比值x分別為5.734、11.47、28.67、57.34、114.7、286.7,得到除蟲脲與內(nèi)標(biāo)TPP定量離子豐度比值y,以x為線性橫坐標(biāo),y為線性縱坐標(biāo),用最小二乘法進(jìn)行線性擬合,得到標(biāo)準(zhǔn)線性方程y=kx+b及相關(guān)系數(shù)R2,結(jié)果詳見表3。

    基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)偏差:

    基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

    式中:n為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液測定的點(diǎn)數(shù),n=6;p為樣品平行測定的個(gè)數(shù),p=6;yi為各基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度對應(yīng)的響應(yīng)比值(Ai目標(biāo)物/Ai內(nèi)標(biāo));x0為樣品測得濃度均值,以回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線校正所得含量均值計(jì),為97.70 ng/mL(表4);xˉ為標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)濃度的平均值,為84.10 ng/mL(表3);b為直線截距,為0.007 3。

    表3 基質(zhì)標(biāo)曲擬合數(shù)據(jù)

    注:把xi代入直線方程得理論y值,把yi代入直線方程得理論x值。

    因此,基質(zhì)標(biāo)曲擬合的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度μr(2.2)=0.012。

    2.3 茶葉試樣前處理產(chǎn)生的不確定度μr(2.3)

    試樣稱量、稀釋時(shí)產(chǎn)生的不確定度是未知試樣前處理過程常見的不確定度。實(shí)驗(yàn)全程加入同一瓶內(nèi)標(biāo)使用液,內(nèi)標(biāo)濃度一致,由于考慮了內(nèi)標(biāo)使用體積產(chǎn)生的不確定度,即試樣稀釋體積不影響到定量結(jié)果,實(shí)驗(yàn)無需再考慮試樣前處理稀釋體積引起的不確定度。

    2.3.1 茶葉試樣稱量產(chǎn)生的不確定度μr(m)

    檢定天平檢定證書,其最大允許誤差為0.5 mg,已知稱樣2 g,取矩形分布,則標(biāo)準(zhǔn)不確定度μ(m)=0.289 mg,相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為μr(m)=0.000 1。

    2.3.2 茶葉試樣加入內(nèi)標(biāo)體積產(chǎn)生的不確定μr(v)

    前處理過程在茶葉試樣中加入0.1 mL內(nèi)標(biāo)TPP使用液,根據(jù)移液槍檢定證書容量允差及溫度波動(dòng)引起的體積變化(表2),相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度μr(v)=0.009。

    由此,未知試樣前處理時(shí)產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度μr(2.3):

    2.4 茶葉試樣測定重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度μr(2.4)

    準(zhǔn)確稱取6份茶葉試樣,經(jīng)提取、凈化步驟,進(jìn)樣分析。試樣平行測量結(jié)果見表4。

    表4 試樣測定重復(fù)性結(jié)果

    試樣測定均值Sˉ=0.479 mg/kg(n=6),標(biāo)準(zhǔn)偏差S樣品=0.006 2 mg/kg,標(biāo)準(zhǔn)不確定度mg/kg,相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

    2.5 茶葉試樣加標(biāo)回收產(chǎn)生的不確定度μr(2.5)

    稱取陰性基質(zhì)隨行加標(biāo),考察回收率產(chǎn)生的不確定度。陰性基質(zhì)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)進(jìn)行6次測定(n=6),除蟲脲加標(biāo)量為114.7 ng,回收率計(jì)算結(jié)果見表5。

    表5 茶葉中除蟲脲加標(biāo)回收率結(jié)果

    加收率均值Sˉ=95.2%(n=6),回收率標(biāo)準(zhǔn)偏差S回收=1.4%,標(biāo)準(zhǔn)不確定度相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

    使用t檢驗(yàn)法檢驗(yàn)平均回收率與回收率期望值100%的差異:

    查表得,t0.95(5)=2.57<8.00,顯示回收率結(jié)果與100%有顯著性差異,表明樣品測定需要用回收率進(jìn)行結(jié)果校正,校正后的結(jié)果為0.503 mg/kg。

    2.6 不確定度的合成

    除蟲脲各分量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表6,則除蟲脲的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

    表6 茶葉中除蟲脲各分量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度統(tǒng)計(jì)

    折算成除蟲脲合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    2.7 擴(kuò)展不確定度及結(jié)果

    在P=95%置信水平,測量結(jié)果擴(kuò)展不確定度取擴(kuò)展因子k=2,則茶葉中除蟲脲殘留量測定的擴(kuò)展不確定度為:U(C)=kμ(C)=0.028 mg/kg。因此,茶葉試樣中除蟲脲的殘留量表示為(0.503±0.028)mg/kg(k=2)。

    3 結(jié)論與討論

    通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中除蟲脲殘留量的不確定度,得出該測定方法的擴(kuò)展不確定度為0.028 mg/kg。從表6可見,稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)產(chǎn)生的不確定度μr(2.1)分量對合成不確定度的貢獻(xiàn)最大,標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過程產(chǎn)生的不確定度μr(2.2)次之。其中,在合成μr(2.1)眾多的小分量中,配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)引入的不確定度μr(V),影響最為顯著。因此,配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)使用允差范圍小的移液槍,保持恒溫恒濕的實(shí)驗(yàn)環(huán)境,注意操作人員的熟練水平,把控好內(nèi)標(biāo)加入體積的重復(fù)性,皆有助于減小配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度。此外,盡可能提高曲線擬合的線性,例如標(biāo)準(zhǔn)曲線每個(gè)點(diǎn)測量多次,測量值取平均值進(jìn)行擬合,線性范圍內(nèi)多取幾個(gè)濃度點(diǎn),并確保樣品測定結(jié)果在曲線范圍的中高段等,可降低測定結(jié)果的不確定度。

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