響應(yīng)面法優(yōu)化南非葉總黃酮的超聲提取工藝

葉雅沁， 李泳寧， 李小芬， 潘大仁

(1.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 福建 福州 350101； 2.福建農(nóng)林大學(xué)， 福建 福州 350002)

南非葉別稱扁桃斑鳩菊，屬菊科(Asteraceae或者Compositae)斑鳩菊屬(Vernonia)，原產(chǎn)于熱帶非洲，該植物既可入藥，也是廣泛食用的蔬菜[1]。近年來一些研究報(bào)道表明，南非葉具有防癌[2]、抗癌[3]、抗菌[4]、抗氧化[5]等多種效用而受到研究者的關(guān)注。南非葉具有多種生物活性成分，如皂苷、生物堿、黃酮類、蒽醌類、氧雜蒽酮和倍半萜等[6-7]，但其研究多聚焦于以甾體皂苷類化合物和倍半萜內(nèi)酯類化合物為主的單體研究，而對(duì)黃酮類藥物的提取和應(yīng)用研究則報(bào)道較少，國內(nèi)外研究人員所提取出的倍半萜內(nèi)酯類化合物及其衍生物就有200種左右，其中3種母核類型E、G、H 的倍半萜內(nèi)酯分布較為廣泛[8]。

目前，大量的研究表明，黃酮類藥物具有多種生理功效，如降低膽固醇[9]、抗氧化[10]、防癌抗癌[11]、降血脂、血糖[12]、抑菌[13-14]、抗病毒[15]、解痙攣[16]、抗凝血[17]和祛痰[18]等重要功能。黃酮類是南非葉中的主要化學(xué)成分之一，但南非葉中總黃酮的提取條件則鮮見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。由于超聲輔助溶劑進(jìn)行提取，可使溶劑更容易滲透到細(xì)胞中，從而縮短提取時(shí)間、提高提取率。因此，研究先采用超聲輔助提取法對(duì)提取溫度、乙醇濃度、超聲時(shí)間和液料比等影響總黃酮提取效果的因素進(jìn)行研究，再根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選取乙醇濃度、超聲時(shí)間和液料比3個(gè)敏感度較高的因素為約束條件，以總黃酮提取量為判斷依據(jù)，采用響應(yīng)面法對(duì)南非葉的總黃酮超聲提取條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為南非葉中總黃酮藥理活性的深入研究及制劑的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

南非葉：采集于福建農(nóng)林大學(xué)實(shí)驗(yàn)田，經(jīng)鑒定為菊科(Asteraceae或者Compositae) 斑鳩菊屬(Vernonia)扁桃斑鳩菊(VernoniaamygdalinaDel．)。

試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，購于中國藥品食品檢定研究所，其他試劑均為分析純。

儀器：UV-2550紫外分光光度計(jì)，日本島津；KQ-700DE超聲波提取儀，昆山市超聲儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；SY5000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DHG-9246A電熱恒溫干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制精密稱取5.5 mg的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品到25 mL容量瓶?jī)?nèi)，加入10 mL的70%乙醇溶解標(biāo)準(zhǔn)品，上下顛倒搖勻，再加入70%乙醇定容至25 mL，其溶液終質(zhì)量濃度為0.22 mg/mL。

1.2.2最佳吸收波長(zhǎng)確定與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精密量取1.5 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入10 mL具塞試管內(nèi)，加入70%乙醇至5 mL，加入0.3 mL 5%NaNO2溶液，微微震搖后，室溫下放置6 min，再加入0.3 mL 10%Al(NO3)3溶液，微微震搖后，室溫下放置6 min，再加入4%NaOH溶液4 mL，最后加70%乙醇溶液至10 mL，靜置20 min，使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。掃描波長(zhǎng)為200～700 nm，觀察吸收峰，確定最佳吸收波長(zhǎng)。分別精密吸取0 mL、0.25 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、3 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，將其加入到7個(gè)10 mL容量瓶?jī)?nèi)，加入70%乙醇溶液至5 mL，在最佳吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3總黃酮含量的測(cè)定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[19]。取供試液0.5 mL置于10 mL刻度試管中，添加70%乙醇至5 mL，加5% NaNO2溶液0.3 mL，震搖，靜置6 min，然后加10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，震搖，靜置6 min，再加4%NaOH溶液4 mL，最后加70%乙醇溶液至10 mL，靜置20 min，利用分光光度計(jì)于510 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.4單因素試驗(yàn)采集的非南葉樣品置于60℃的烘箱中干燥48 h，粉碎，準(zhǔn)確稱取南非葉粉約1.0 g，用提取時(shí)間50 min、乙醇濃度70%、液料比20∶1、提取溫度40℃ 4個(gè)條件作為單因素篩選試驗(yàn)的基礎(chǔ)。在考察某個(gè)因素時(shí)，保持其他條件為定值，進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。超聲時(shí)間，分別提取20 min、30 min、40 min、50 min、60 min和70 min；乙醇體積分?jǐn)?shù)，分別為40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%；液料比(mL∶g)分別為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1和60∶1；溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃和70℃。將不同因素下提取得到的提取液在8 000 r/min離心5 min后，進(jìn)行抽濾。濾液揮發(fā)干，加入70%乙醇溶解定容到25 mL容量瓶中，搖勻，制成總黃酮提取液。根據(jù)1.2.3測(cè)定提取液中總黃酮含量(mg/g)，從而計(jì)算出南非葉粉末中該物質(zhì)的量。

總黃酮含量=測(cè)得的南非葉總黃酮量/所用的干粉量

1.2.5響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)Design-Expert 8.06 中Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，在50℃下選擇提取時(shí)間、乙醇濃度、液料比3個(gè)比較敏感并可調(diào)控的因素開展試驗(yàn)。其因素及水平設(shè)置見表1。每個(gè)因素和水平3次重復(fù)，取平均值。優(yōu)化南非葉總黃酮的提取條件，得到最佳提取條件。

表1 超聲提取南非葉總黃酮的響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平

2結(jié)果與分析

2.1最佳吸收波長(zhǎng)及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

從圖1可知，蘆丁在510 nm處有最大吸收波長(zhǎng)，因此，后續(xù)試驗(yàn)測(cè)定波長(zhǎng)為510 nm。從圖2可知，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的回歸方程為y=18.152x-0.000 7(R2=0.995 8)，表明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度在0～0.066 mg/mL的線性關(guān)系較好。

2.2不同因素對(duì)南非葉總黃酮含量的影響

從圖3可知，不同超聲提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比及溫度下的南非葉總黃酮提取量變化。

2.2.1超聲時(shí)間隨時(shí)間的延長(zhǎng)，南非葉總黃酮含量增加，在超聲時(shí)間50 min時(shí)含量最高，為13.43 mg/g，隨后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，南非葉總黃酮含量反而下降，可能是由于提取時(shí)間過長(zhǎng)造成了黃酮類化合物的分解。因此超聲提取時(shí)間宜為50 min左右。

2.2.2乙醇體積分?jǐn)?shù)南非葉總黃酮的含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高先增加再減少。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，總黃酮含量最大，為14.00 mg/g，再增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，其含量開始降低?？赡苁怯捎邳S酮類化合物作為弱極性物質(zhì)，根據(jù)相似相溶原理，在純水中難以溶解，因此體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇與南非葉總黃酮的極性相近，所以后者在該體積分?jǐn)?shù)下溶解度最大。而隨著體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)升高，提取液的極性與被提取物的極性相似度降低，反而使得含量下降。因此，試驗(yàn)選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)80%作為后續(xù)反應(yīng)條件。

2.2.3液料比隨著液料比的增大，南非葉總黃酮的含量也增大，當(dāng)液料比達(dá)40∶1時(shí)，含量最高，為16.36 mg/g，隨后不再增加。由于提取溶劑量越大，活性成分就越容易溶出，但增大溶劑體積，其總黃酮量則被稀釋，其含量則出現(xiàn)下降，結(jié)合經(jīng)濟(jì)效益，液料比40∶1為較適宜的比例。后續(xù)試驗(yàn)采用40∶1的條件進(jìn)行。

2.2.4溫度當(dāng)溫度從30℃到50℃時(shí)，南非葉總黃酮含量逐漸增加；提取溫度為50℃，總黃酮含量最高，為16.58 mg/g；溫度繼續(xù)增加，其總黃酮含量不再升高，趨向平衡。因此，試驗(yàn)以50℃作為后續(xù)的反應(yīng)溫度。

2.3南非葉總黃酮提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

從表2可知，不同處理的南非總黃酮含量。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析得線性回歸方程模型為Y=16.47-0.14A-0.31B+0.037C-0.30AB+0.23AC-0.038BC-0.20A2-0.31B2-0.79C2。 對(duì)該模型進(jìn)行顯著性分析表明，模型一次項(xiàng)B的P值為0.008 6，二次項(xiàng)C的P值為0.000 3，對(duì)南非葉總黃酮含量影響極顯著，交互項(xiàng)AB、二次項(xiàng)B的P值分別為0.044 8和0.033 3，對(duì)南非葉總黃酮含量影響顯著?；貧w方程的P<0.05，失擬檢驗(yàn)P=0.099 6>0.05，表明此方程具有明顯的顯著性，可以有效地對(duì)現(xiàn)實(shí)情況進(jìn)行擬合。R2=0.923 6說明相關(guān)性較好。因此，可用該方程對(duì)南非葉總黃酮的含量進(jìn)行預(yù)測(cè)。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

2.4最佳工藝條件確定及驗(yàn)證

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果表明，其最佳工藝為50℃下，超聲提取50.50 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)74.78%，液料比40.43∶1 ，在該條件下南非葉總黃酮提取含量的預(yù)測(cè)值為16.545 8 mg/g?？紤]到實(shí)際操作的可能性，選用在50℃下，超聲提取時(shí)間51 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、液料比40∶1為最佳條件。在此提取條件下，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，提取的總黃酮含量達(dá)16.47 mg/g，與預(yù)測(cè)值基本相符，說明模型能較好的預(yù)測(cè)總黃酮的含量。

3結(jié)論

試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上考察超聲時(shí)間、乙醇濃度及液料比3個(gè)主要因素，并以總黃酮含量為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken原理采用3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化。超聲輔助法提取南非葉總黃酮的最佳提取條件為超聲時(shí)間51 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、液料比40∶1(mL∶g)，該條件下提取的總黃酮含量為16.47 mg/g，與預(yù)測(cè)值16.545 8 mg/g基本相符，模型能較好地預(yù)測(cè)總黃酮的含量。建立的南非葉總黃酮提取方法操作簡(jiǎn)單、提取率高，可為南非葉的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。