聚六亞甲基雙胍對金魚嗜水氣單胞菌的殺滅及金魚細(xì)菌性疾病的治療效果

馮亞明， 楊智景， 顧海龍， 王建國， 朱 峰， 朱宏慶， 戴傳志

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 泰州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 泰州 225300； 2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院， 江蘇 泰州 225300)

金魚(Cyprinuscarpio)起源于中國，是世界上最早的觀賞魚養(yǎng)殖品種之一[1]。因其具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和文化價(jià)值，受到世界各國人民的喜愛，觀賞魚的養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴(kuò)大。金魚養(yǎng)殖密度較大，發(fā)生疾病的機(jī)率高，不僅影響其觀賞價(jià)值，還嚴(yán)重影響其生長發(fā)育和繁殖，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。金魚為非食用魚類，用藥沒有嚴(yán)格限制，抗生素濫用現(xiàn)象普遍，病菌的耐藥性發(fā)展較快，導(dǎo)致一些常規(guī)的疾病都難于控制。聚六亞甲基胍(Polyhexamethylene biguanide hydrochloride， PHMB)為環(huán)保型高分子聚合物殺菌消毒劑，為無色、無嗅、不燃、不爆的液體，具有殺菌譜廣、有效濃度低、作用速度快、性質(zhì)穩(wěn)定、易溶于水的優(yōu)良性能，可在常溫下使用，長期抑菌，無腐蝕性[3]。其水溶液中能產(chǎn)生電離，親水基部分含有強(qiáng)烈的正電性，吸附呈負(fù)電性的各類細(xì)菌、病毒，進(jìn)入細(xì)胞膜能抑制膜內(nèi)脂質(zhì)體合成，造成菌體凋亡，達(dá)到最佳的殺菌效果[4]，是前景較好的抗生素替代品[5]。目前，聚六亞甲基雙胍對金魚疾病控制效果的研究報(bào)道較少，因此，于2019年在江蘇省沈高鎮(zhèn)某金魚養(yǎng)殖場進(jìn)行聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽對金魚嗜水氣單胞菌的殺滅效果、金魚急性毒性作用及金魚細(xì)菌性疾病的治療效果試驗(yàn)，以期為金魚疾病的控制和減少抗生素藥品的使用提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽為山東優(yōu)索化工科技有限公司生產(chǎn)，含量為20%(濃度為200 g/L)。金魚為江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院飼養(yǎng)的草種金魚。在水族箱中飼養(yǎng)2個月以上，活力旺盛，吃食正常，體重(23.15±2.38)g。試驗(yàn)用水為曝氣72 h以上的自來水，水溫(23.1±1.4)℃，pH 7.2～7.6，硬度約120 mg/L。每天虹吸出糞便、殘食。

1.2病原提取及診斷

1.2.1金魚發(fā)病情況2019年4月12日，江蘇省沈高鎮(zhèn)某金魚養(yǎng)殖場的金魚出現(xiàn)較嚴(yán)重的死亡現(xiàn)象，病魚胸鰭及鱗片下皮膚出血、眼球出血，解剖后腹腔有紅色血樣粘稠液體，腎臟腫大出血，經(jīng)初步診斷為細(xì)菌性疾病。常規(guī)用藥治療后效果不明顯，顯示出對多種抗生素具有耐藥性。

1.2.2病原提取從養(yǎng)殖場采集瀕死病魚在江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院水產(chǎn)科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌病原分離，得到大量細(xì)菌培養(yǎng)物。按照科赫法則原理，采用江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院飼養(yǎng)的健康1齡金魚，注射細(xì)菌純培養(yǎng)物，產(chǎn)生了相同癥狀，重新分離細(xì)菌菌株，純培養(yǎng)后經(jīng)16sRNA鑒定為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)，確定為該病病原。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1聚六亞甲基雙胍殺菌效果試驗(yàn)將病原菌用生理鹽水稀釋至7.44×104cfu/mL，將病原菌懸液200 mL置于滅菌的三角燒瓶中，添加聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽，使其濃度分別為0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.03 mg/L、0.04 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.20 mg/L、0.40 mg/L、0.80 mg/L、1.60 mg/L，每個濃度為1個處理，以不加藥物作為對照，3次重復(fù)。藥液和菌液充分混合后放入搖床輕輕震動培養(yǎng)2 h，然后從每組混合液中吸取0.1 mL用玻璃涂抹棒均勻涂抹在滅菌冷卻的營養(yǎng)瓊脂平板上，平板直徑為90 mm。涂抹完成后放入恒溫生化培養(yǎng)箱(普天SHP-160E)，30℃培養(yǎng)24 h,計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)量。

1.3.2聚六亞甲基雙胍對金魚的毒性試驗(yàn)依照預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置5個濃度試驗(yàn)組，分別為0.3 mg/L、0.6 mg/L、0.9 mg/L、1.2 mg/L、1.5 mg/L和1個空白對照組，3次重復(fù)。每組隨機(jī)放入活力旺盛的草金魚10尾，記錄24 h、48 h、72 h、96 h的死亡數(shù)，死亡個體即刻移出。死亡判定標(biāo)準(zhǔn)為玻璃棒多次觸及無任何反應(yīng)即判定為死亡。試驗(yàn)期間持續(xù)充氣，隔24 h更換藥液1次，試驗(yàn)期間不投食。

1.3.3聚六亞甲基雙胍臨床使用效果根據(jù)實(shí)驗(yàn)室得出的最低有效濃度和金魚的半致死濃度設(shè)定治療濃度，均勻潑灑到生病的池塘。池塘規(guī)格為3 m×3 m×0.4 m，實(shí)際水量3 t，治療期間24 h開啟增氧機(jī)，增氧方式為渦旋鼓風(fēng)機(jī)(森森，HG-3000)柱狀氣泡石增氧，每池4個氣泡石，試驗(yàn)期間用溶氧儀(YSI-550A)檢測溶氧量均在5 mg/L以上。水色濃綠色，透明度(23±4)cm，檢測總菌量平均值為3.62×104cfu/mL。選擇病嚴(yán)重的水泥池10個，每池約有1萬尾金魚，每天死亡500～600尾魚。按照毒性試驗(yàn)和殺菌試驗(yàn)的結(jié)果設(shè)置治療濃度為0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L，設(shè)1個空白對照組，每平行2個池，用藥后每天計(jì)數(shù)死亡量，并采集池水測定總菌量。

1.4數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用Excel 2010整理后求平均值，數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用Trimmed Spearman-Karber法[6]求24 h、48 h、72 h和96 h的半致死濃度值(LC50)；安全濃度(SC)的計(jì)算參照文獻(xiàn)[7]中的方法(SC=96 h 的LC50值×0.1)。用SPSS 19.0進(jìn)行比較分析，ANOVA和Duncan多重比較進(jìn)行各組之間平均值的差異顯著性檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽的殺菌效果

從圖1看出，當(dāng)聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽濃度為0.01 mg/L時，細(xì)菌菌落數(shù)量顯著下降，菌落數(shù)量為對照的27.15%；濃度為0.01～0.03 mg/L時菌落數(shù)量差異不顯著；濃度為0.04 mg/L時菌落數(shù)顯著下降，菌落數(shù)量為對照的9.40%；濃度在0.05～0.40 mg/L時，菌落數(shù)量顯著變少，僅為對照的1%，但各濃度處理間菌落數(shù)量差異不顯著。濃度高于0.4 mg/L時菌落數(shù)為0。表明，聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽濃度為0.01 mg/L對嗜水氣單胞菌具有較好的預(yù)防效果，當(dāng)濃度達(dá)0.05 mg/L時具有較好的治療效果。

2.2聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽對金魚的毒性

經(jīng)觀測，金魚進(jìn)入0.9 mg/L以上濃度的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽溶液中時表現(xiàn)躁動，四處亂撞，呼吸頻率明顯加快，魚體表粘液增多，水中出現(xiàn)大量絮狀物質(zhì)；中毒魚游泳無力，呼吸頻率變慢，脫黏，體色發(fā)白；瀕臨死亡的魚完全失去平衡，呼吸極度虛弱，鰓絲發(fā)白。從圖2看出，濃度為1.5 mg/L、1.2 mg/L的處理金魚24 h內(nèi)完全死亡，其中，1.5 mg/L處理10 h開始出現(xiàn)死亡，18 h全部死亡；0.9 mg/L處理24 h時金魚成活率80%，72 h時僅20%，96 h時全部死亡；0.6 mg/L處理48 h時金魚存活率100%，72 h時為80%，96 h時為40%；0.3 mg/L處理96 h時金魚成活率仍然為100%。從表1看出，24 h的LC50為0.97 mg/L，48 h的LC50為0.90 mg/L，72 h的LC50為0.71 mg/L，96 h的LC50為0.59 mg/L，安全濃度為0.06 mg/L。

表1 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽對金魚的急性毒性值及其95%置信區(qū)間

2.3聚六亞甲基雙胍臨床使用效果

2.3.1不同處理的細(xì)菌總量從圖3看出，對照3 d內(nèi)細(xì)菌總量逐漸增加，差異不顯著。聚六亞甲基雙胍濃度為0.05 mg/L、0.1 mg/L和0.2 mg/L處理24 h內(nèi)水體細(xì)菌總量均顯著減少，細(xì)菌總量分別為起始濃度的6.15%、1.15%和0.7%。48～72 h各處理的細(xì)菌總量為起始濃度的0.5%～2.7%，差異不顯著，說明細(xì)菌數(shù)量得到有效控制。

2.3.2不同處理金魚的死亡數(shù)從表2看出，使用濃度在0.05～0.10 mg/L處理24 h死魚數(shù)量顯著減少(P<0.05)，0.20 mg/L處理死魚數(shù)量略多于對照組，但差異不顯著(P>0.05)，0.40 mg/L處理死魚數(shù)量顯著高于對照組(P<0.05)，但和0.20 mg/L處理差異不顯著(P>0.05)。48 h用藥處理死魚數(shù)量均顯著少于對照(P<0.05)，其中，0.20 mg/L以上濃度的處理顯著小于0.10 mg/L以下濃度的處理(P<0.05)。72 h用藥處理顯著少于對照(P<0.05)，各濃度處理間差異不顯著(P>0.05)。96 h時0.20 mg/L以上濃度組沒有死魚，0.1 mg/L以下濃度組有少量死魚，但4個治療處理死魚數(shù)沒有顯著差異(P<0.05)。試驗(yàn)期間總死魚量用藥處理均顯著低于對照(P<0.05)，0.20 mg/L以上濃度處理顯著高于0.10 mg/L以下濃度處理，說明藥物濃度≥0.2 mg/L可能對生病金魚具有刺激性，會加速病魚死亡。

表2 不同濃度聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽處理生病金魚不同時間的死亡魚數(shù)

3結(jié)論與討論

3.1聚六亞甲基胍對細(xì)菌的殺滅效果

聚六亞甲基胍是一種新型環(huán)保型殺菌劑，廣泛應(yīng)用于餐具、醫(yī)療器械、粘膜系統(tǒng)的消毒[3]。聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽殺滅細(xì)菌作用快，在2 h內(nèi)能讓細(xì)菌失活死亡(待報(bào)道)。秦志華等[8]報(bào)道，0.5 mg/L濃度的聚六亞甲基雙胍對海水副溶血弧菌和鰻弧菌具有較好的殺滅效果，3 h內(nèi)殺菌率達(dá)97.6%，比1 mg/L的二氯異氰尿酸(22.5%)高75.1%，且效果更加持久穩(wěn)定。研究表明，聚六亞甲基胍濃度為0.05 mg/L對嗜水氣單胞菌殺菌率高達(dá)99%，實(shí)際在水泥池治療使用中殺菌率為93.85%，略低于實(shí)驗(yàn)室殺菌率，但明顯降低了細(xì)菌總量，有效控制了疾病。劉志軒等[9]比較了ClO2-、PHMG、H2O2及PVPI 對4種弧菌副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)及Vibriosp.Ex25的殺滅作用，發(fā)現(xiàn)PHMB殺菌率隨時間的推移逐漸升高，0.125 mg/L的PHMG可使養(yǎng)殖水體中的弧菌總量在第4天降到最低值，到第11天時弧菌總量仍然維持在消毒前初始值的3.58%，有效殺菌濃度與本研究相似。谷桂英等[10]發(fā)現(xiàn)，4 mg/L的PHMB在1 h內(nèi)能完全殺死大黃魚致病弧菌。現(xiàn)有研究表明，PHMB和其他幾種消毒劑相比具有高效、持久等優(yōu)點(diǎn)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中將會有良好的應(yīng)用前景。

3.2聚六亞甲基胍對金魚的毒性

王群等[11]研究發(fā)現(xiàn)，聚六亞甲基雙胍對凡納濱對蝦幼蝦24 h和48 h的LC50為64.1 mg/L和31.13 mg/L，安全濃度為2.20 mg/L；對成蝦24 h和48 h的LC50分別為66.17 mg/L和32.16 mg/L，安全濃度為2.28 mg/L，0.5 mg/L濃度以內(nèi)對無節(jié)幼體的變態(tài)率無明顯影響，建議用量控制在0.5 mg/L內(nèi)。對球等鞭金藻和亞心形扁藻的生長不產(chǎn)生抑制的最高濃度為5 mg/L，安全濃度分別3.5 mg/L和2.9 mg/L。研究發(fā)現(xiàn)，金魚對聚六亞甲基雙胍比較敏感，24 h、48 h、72 h、96 h的LC50分別為0.97 mg/L、0.90 mg/L 0.71 mg/L及0.59 mg/L，遠(yuǎn)低于凡納濱對蝦，濃度較高時金魚很容易發(fā)生死亡。蘇筱竺[12]研究了PHMB對雙齒圍沙蠶(Perinereisaibuhitensis)24 h、48 h、72h的LC50分別為0.059 mg/L、0.057 mg/L、0.052 mg/L，安全濃度為0.016 mg/L，雖然能短時間內(nèi)降低雙齒圍沙蠶體內(nèi)微生物的比例，但因?yàn)閷ζ涮舾胁贿m宜作為細(xì)菌病治療藥物。曹鑫磊[13]在22℃下試驗(yàn)了苯扎溴銨絡(luò)合碘對平均體質(zhì)量6.3 g的金魚96 h為0.878 mg/L。SHUN等[14]研究了三氯異氰尿酸，戊二醛，高錳酸鉀對金魚48 h的LC50為4.1 mg/L、8.8 mg/L、5.9 mg/L。PHMB和苯扎溴銨絡(luò)合碘相比，對金魚的毒性相似，和三氯異氰尿酸，戊二醛，高錳酸鉀相比，毒性要大于這些常規(guī)消毒藥物。根據(jù)研究的毒性試驗(yàn)結(jié)果，建議在金魚上的使用安全濃度為0.06 mg/L。

3.3聚六亞甲基胍在防治魚類細(xì)菌性疾病的應(yīng)用價(jià)值

金魚場發(fā)生疾病時常使用過三氯異氰尿酸和聚維酮碘消毒治療，但在安全濃度范圍用藥時，水體中的細(xì)菌總量降下去后很快反彈，疾病沒有得到有效控制。使用PHMB后水體總菌量迅速下降，疾病逐漸得到控制。在中國對蝦[8]、凡納濱對蝦[9]、大鱗鲆[15]等海水魚蝦弧菌引起的疾病防控中發(fā)現(xiàn)，PHMB具有消毒效果快，藥效持久等特點(diǎn)，和當(dāng)前常用的消毒相比其對多種病原的消毒效果好[16]。谷娜等[17]為了治理水體中銅綠微囊藻污染物,用聚六亞甲基雙胍(PHMB)-磁性蒙脫土去除水體銅綠微囊藻發(fā)現(xiàn)，1 mg/L的 PHMB和14 mg/L的磁性蒙脫土共同作用時，水體中銅綠微囊藻葉綠素a去除率及濁度的去除率分別達(dá)96%和85%，具有明顯的凈化水質(zhì)作用，所以PHMB是一種非常具有潛力的細(xì)菌病防治新藥。

毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，PHMB對不同類型動物毒性差別較大，對蝦蟹毒性相對較小，而對魚類、沙蠶類動物毒性較大。在使用PHMB治療金魚嗜水氣單胞菌引起的疾病過程中也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃度0.20 mg/L時對魚體產(chǎn)生一定的刺激性，加速了病魚的死亡，使3 d內(nèi)的總死魚量顯著高于0.10 mg/L以下濃度。所以PHMB在用于防治蝦蟹類細(xì)菌疾病時是相對較安全的藥物，但用于魚類細(xì)菌性疾病時，還需做大量的毒性試驗(yàn)研究，慎重使用，以防發(fā)生藥害。