赤松茸多糖的提取及對(duì)小鼠免疫力的影響

伍玉蘭 馮婉瀅 張玲雨 王曉琛 張穎穎

摘 要：目的：從赤松茸中提取粗多糖，并探討其對(duì)小鼠免疫功能的影響。方法：采用水提醇沉的方法提取赤松茸多糖，取40只雌性昆明小鼠，分為5組，隨后用不同劑量的赤松茸多糖（200、100、50 mg/kg·d）灌胃，7 d后檢測(cè)小鼠臟器指數(shù)及血清干擾素γ（IFN-γ）指標(biāo);用MTT法研究赤松茸多糖對(duì)小鼠脾臟細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞體外增殖影響。結(jié)果：體內(nèi)對(duì)照研究顯示：赤松茸多糖可有效提高脾臟、胸腺指數(shù)及血清IFN-γ水平（P<0.05）;體外對(duì)照研究顯示：在區(qū)間內(nèi)，赤松茸多糖可顯著促進(jìn)脾臟細(xì)胞（0.25～2 mg/mL，P<0.05）以及巨噬細(xì)胞（0.5～1 mg/mL，P<0.05）增殖。結(jié)論：赤松茸多糖對(duì)小鼠免疫力有明顯增強(qiáng)作用，對(duì)細(xì)胞免疫的增強(qiáng)效果尤為顯著。

關(guān)鍵詞：赤松茸多糖;IFN-γ;免疫活性;環(huán)孢素A;水提醇沉

赤松茸是一種與赤松林樹根共生的野生食用菌[1]，近年來(lái)已人工培育成功，是歐美各國(guó)栽培的著名食用菌之一，也是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織推薦發(fā)展中國(guó)家栽培的食用菌之一[2]，且目前已在我國(guó)引種成功。作為具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的食用菌之一，赤松茸子實(shí)體中富含蛋白質(zhì)、維生素、多糖和礦物質(zhì)等化學(xué)成分，其中多糖為其所含重要生物活性物質(zhì)，具有提升機(jī)體免疫能力的功效，這表明赤松茸還具有藥用價(jià)值，是珍貴的藥食兩用真菌[3-5] 。近年來(lái)，食用真菌的深度開發(fā)利用成為研究熱點(diǎn)，多糖是其主要有效成分之一，目前市場(chǎng)上已有的真菌多糖類保健品達(dá)上百種[6] 。但赤松茸多糖的相關(guān)研究尚少，國(guó)內(nèi)已有研究多集中于赤松茸多糖的發(fā)酵條件、抑菌作用、抗氧化活性及對(duì)小鼠心血管系統(tǒng)的影響[5]，對(duì)其免疫活性的藥理研究報(bào)道較少。為深入研究赤松茸多糖對(duì)機(jī)體免疫功能的影響，本實(shí)驗(yàn)從赤松茸中提取了多糖，以環(huán)孢素A建立小鼠免疫缺陷模型，研究赤松茸多糖對(duì)小鼠體內(nèi)免疫的影響，并以脾臟細(xì)胞、巨噬細(xì)胞對(duì)其體外免疫活性進(jìn)行研究，以期為臨床赤松茸營(yíng)養(yǎng)食品和藥品開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明系（KM）小鼠40只，雌性，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～20g，購(gòu)于濟(jì)南朋悅動(dòng)物繁育有限公司，合格證號(hào)SCXK（魯）20140007。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 小鼠血清的IFN-γ試劑盒，北京中科海博科技有限公司，批號(hào)：201705;環(huán)孢素A、75%乙醇、80%乙醇、丙酮、蒸餾水、生理鹽水、PBS緩沖液，Thermo Fisher Scientific;RPMI-1640培養(yǎng)液，Thermo Fisher Scientific;一次性無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)皿，上海廣銳生物科技有限公司;EP管、DragonLab移液器（20、100、200、1 000 μL）及配套吸頭、200目鋼絲網(wǎng)、雙抗（青霉素與鏈霉素混合液），Thermo Fisher Scientific;紅細(xì)胞裂解液，Solarbio Life Sciences。

1.2.2 儀器 高速離心機(jī)TD5A，鹽城凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;LGJ-18A冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司;恒溫磁力攪拌器，環(huán)宇科學(xué)儀器廠;普朗DNM-9602酶標(biāo)、N-3010旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，EYELA東京理化器械株式會(huì)社;BS210S電子天平，Sartorius;數(shù)碼生物顯微攝影系統(tǒng)，上海彼愛(ài)姆光學(xué)儀器制造有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;CO2培養(yǎng)箱，Thermo Fisher Scientific;光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡，奧林巴斯。

2 方法

2.1 赤松茸多糖的提取

如附圖所示[7-8]提取赤松茸多糖。將松茸子實(shí)體烘干后粉碎過(guò)篩，準(zhǔn)確稱取600 g子實(shí)體粉末，按料水比1∶ 25加入蒸餾水（g∶ mL），置于恒溫?cái)嚢杵髦?，轉(zhuǎn)速600 r/min、75 ℃加熱、浸提20 min，離心。重復(fù)浸提1次，將兩次上清液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至適當(dāng)體積。然后加入75%乙醇，醇沉，于4 ℃冰箱靜置12 h，離心，收集沉淀，用80%乙醇和丙酮各洗3次。用適量蒸餾水復(fù)溶沉淀并冷凍干燥，冷凍干燥后將其配制成1%水溶液。用Sevag試劑（氯仿∶ 正丁醇=4∶ 1）7.5 mL，振蕩15 min，以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心3 min，去除游離蛋白，最后再次用75%乙醇沉淀得粗多糖，冷凍干燥后備用。

2.2 體內(nèi)免疫活性

2.2.1 造模與給藥 將40只雌性小鼠隨機(jī)分為5組：正常組、模型組和赤松茸多糖高、中、低劑量組，每組8只。除正常組外，其余各組小鼠均連續(xù)3 d腹腔注射環(huán)孢素A（100 mg/kg·d），每天1次，建立免疫低下模型小鼠。隨后分別給予赤松茸多糖高、中、低劑量組小鼠多糖溶液（200、100、50 mg/kg·d）連續(xù)灌胃7 d，每天1次;正常組和模型組則灌胃等量生理鹽水。

2.2.2 小鼠臟器指數(shù)測(cè)定 末次給藥后，測(cè)定小鼠體質(zhì)量，摘眼球取血，脫頸椎處死，分離胸腺和脾臟并稱重。根據(jù)式（1）、（2）計(jì)算各組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)：

2.2.3 IFN-γ含量測(cè)定 收集小鼠血清，用ELISA法測(cè)定各組小鼠血清IFN-γ含量。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書上的步驟操作，測(cè)得相應(yīng)OD值。據(jù)此繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求得其線性方程為y=1 552.6x-100.56，相關(guān)系數(shù)R2=0.994 3，表示在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最后根據(jù)該曲線求出對(duì)應(yīng)IFN-γ含量。

2.3 體外免疫活性

2.3.1 配制藥液 赤松茸多糖用PBS配制成濃度為50 mg/mL的藥液，無(wú)菌過(guò)濾，用前濃度稀釋為10 mg/mL。

2.3.2 小鼠脾臟細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn) 制備小鼠脾臟細(xì)胞懸液[9]，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞生存率大于95%，調(diào)整懸液細(xì)胞濃度為1.5 ×106個(gè)/mL。將該細(xì)胞懸液加入96孔板，每孔加入100 μL。多糖組加入赤松茸多糖藥液，每孔100 μL，使多糖最終濃度分別為0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL，空白組則加入等體積的雙抗RPMI-1640培養(yǎng)液（10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL）。最后采用MTT法進(jìn)行體外培養(yǎng)，將脾臟細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2條件下孵育44 h后取出，參照文獻(xiàn)方法[9]進(jìn)行OD值檢測(cè)。

2.3.3 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn) 制備小鼠腹腔巨噬細(xì)胞懸液[10]，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞生存率大于95%，調(diào)整懸液細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL。將該細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔150 μL，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)3 h，取出，棄上清液，用PBS緩沖液洗滌3次去除未貼壁細(xì)胞，得純化小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。在上述純化后巨噬細(xì)胞96孔板中，多糖組加入赤松茸多糖藥液，每孔100 μL，使多糖最終濃度分別為0.06、0.12、0.25、0.5、1、2 mg/mL，空白組則加入等體積的雙抗RPMI-1640培養(yǎng)液。按2.3.2方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及OD值測(cè)定。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為0.05。

3 結(jié)果與分析

3.1 赤松茸多糖對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

如表1所示，模型組與正常組比較，模型組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均低于正常組，表示造模成功。赤松茸多糖高、中、低劑量組與模型組相比，赤松茸多糖對(duì)小鼠胸腺增長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用，胸腺指數(shù)增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;同時(shí)對(duì)小鼠脾臟也有促增長(zhǎng)作用且隨著劑量增加，脾臟指數(shù)增大，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3.2 赤松茸多糖對(duì)小鼠血清IFN-γ含量的影響

如表2所示，模型組與正常組比較，血清IFN-γ含量明顯降低，表明建模成功。與模型組相比，高劑量組IFN-γ含量顯著升高（P<0.05），且與中、低劑量組差異明顯，說(shuō)明高劑量組可顯著升高免疫低下小鼠IFN-γ含量。

3.3 赤松茸多糖對(duì)小鼠脾臟細(xì)胞的影響

如表3所示，與空白組比較，OD值在0.25～2 mg/mL濃度區(qū)間內(nèi)明顯增大（P<0.05），表明此濃度區(qū)間內(nèi)赤松茸多糖對(duì)小鼠脾臟細(xì)胞的增殖有明顯刺激作用并隨濃度的增加作用增強(qiáng)，存在劑量依賴性;OD值在0.125 mg/mL濃度時(shí)略有增大，在 0.062 5 mg/mL濃度時(shí)略有減小，且兩者與空白組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

3.4 赤松茸多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的影響

如表4所示，與空白組比較，OD值在2 mg/mL濃度時(shí)明顯減?。≒<0.05），在0.5 mg/mL與1 mg/mL濃度時(shí)明顯增大（P<0.05），表明赤松茸多糖在0.5 mg/mL和1 mg/mL濃度時(shí)對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的增殖具有刺激作用且呈現(xiàn)出一定劑量依賴性;但OD值在0.06～0.25 mg/mL濃度區(qū)間內(nèi)雖增大但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

4 討論

多糖是植物的有效成分之一[11]，同時(shí)也廣泛分布于香菇、銀耳、雞蓯菌等真菌中[12] 。現(xiàn)代藥理研究證明，真菌多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、抗放射、抗衰老等功效[13] 。環(huán)孢素A為11個(gè)氨基酸組成的環(huán)狀多肽，是從霉菌代謝產(chǎn)物中提取得到的第三代免疫抑制劑，對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫都有較好的抑制作用[14] 。本實(shí)驗(yàn)以環(huán)孢素A（100 mg/kg·d）連續(xù)3 d對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，成功構(gòu)建免疫低下小鼠模型。

脾臟是人體最大的外周免疫器官，是T/B淋巴細(xì)胞定居和發(fā)生免疫應(yīng)答的主要場(chǎng)所;胸腺是人體的中樞免疫器官，是T淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟的場(chǎng)所，二者均對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)起著重要作用。因此胸腺和脾臟可作為評(píng)判機(jī)體免疫功能強(qiáng)弱的指標(biāo)[15] 。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，赤松茸多糖可有效提高小鼠胸腺、脾臟指數(shù)。其中，胸腺指數(shù)相較于模型組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明赤松茸多糖能增強(qiáng)小鼠胸腺功能，提高小鼠免疫力。而脾臟指數(shù)雖有提高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明其可能也潛在地增強(qiáng)了脾臟功能。體外增殖實(shí)驗(yàn)顯示，赤松茸多糖在0.25～2 mg/mL濃度區(qū)間內(nèi)能夠明顯刺激脾臟細(xì)胞的增殖且該作用存在明顯的量效關(guān)系，體內(nèi)外免疫實(shí)驗(yàn)趨勢(shì)一致，均說(shuō)明赤松茸多糖能夠有效提高機(jī)體免疫應(yīng)答。

巨噬細(xì)胞是體內(nèi)一種重要的固有免疫細(xì)胞[16-17]，可吞噬并消化細(xì)胞殘片與病原體，進(jìn)而清除衰老細(xì)胞[18]、抵擋病原微生物的入侵。因此，通過(guò)測(cè)定藥物干預(yù)后巨噬細(xì)胞的增殖情況，可有效反映藥物對(duì)機(jī)體免疫功能的影響。IFN-γ是細(xì)胞免疫中的主要細(xì)胞因子之一，可由Th1細(xì)胞分泌，能促進(jìn)Th1細(xì)胞自身的增殖分化，同時(shí)具有直接促進(jìn)T/B細(xì)胞分化成熟的作用[19]，從而促進(jìn)機(jī)體免疫應(yīng)答[20] 。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，赤松茸多糖可明顯提高小鼠血清中IFN-γ的含量，且有一定的劑量依賴效應(yīng)，提示在一定程度內(nèi)適量增加松茸多糖劑量可進(jìn)一步增強(qiáng)小鼠免疫功能。此外，小鼠體外腹腔巨噬細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，赤松茸多糖在0.5 mg/mL與1 mg/mL濃度時(shí)能夠明顯刺激巨噬細(xì)胞的增殖，且該作用存在明顯的量效關(guān)系。

綜上所述，赤松茸多糖能夠有效調(diào)節(jié)機(jī)體免疫器官胸腺、脾臟功能以及某些細(xì)胞因子如IFN-γ的分泌，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫力。松茸多糖作用于環(huán)孢素A所致免疫缺陷小鼠后，可有效提高其胸腺、血清IFN-γ水平，作用于體外培養(yǎng)脾臟細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，均可促進(jìn)其增殖，說(shuō)明該多糖對(duì)小鼠的細(xì)胞免疫有較好調(diào)節(jié)作用，有望作為免疫刺激增強(qiáng)劑進(jìn)一步深入開發(fā)。◇

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Abstract：Objective ? To extract the crude polysaccharide from Stropharia rugoso-annulata，and to explore its effect on the immune function of mice.Method ? The polysaccharide of Stropharia rugoso-annulata was extracted by the method of water extraction and alcohol precipitation，40 mice were divided into 5 groups，and the mice were given intragastric administration with different doses of the polysaccharides（200，100，50 mg / kg·d），and the organ index and the serum IFN-γ index were detected after 7 days.The effect of Stropharia rugoso-annulata polysaccharide on the proliferation of spleen cells and peritoneal macrophages in mice was studied by MTT method.Result ? In vivo control study showed that Stropharia rugoso-annulata polysaccharide could effectively increase the level of spleen，thymus index and serum IFN-γ（P<0.05）.In vitro control study showed that Stropharia rugoso-annulata polysaccharide could significantly promote the proliferation of spleen cells（0.25～2 mg/mL，P<0.05）and macrophages（0.5～1 mg/mL，P<0.05）in the interval.Conclusion ? Stropharia rugoso-annulata polysaccharide has a significant effect on mouse immunity，especially on cellular immunity.

Keywords：the polysaccharide from Stropharia rugoso-annulata;IFN-γ;immune activity;cyclosporine A;water-extraction-alcohol-precipitation method