基因多態(tài)性與不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)的相關(guān)性分析

宿喜萍 唐曉琳 陳金蓮 陳多珍

【摘要】目的：探討MTHFR基因多態(tài)性與不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)間的相關(guān)性。方法：本次納入對象為我院婦產(chǎn)科2018年11月～2019年4月收治的不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)患者30例，選取同期于我院婦產(chǎn)科住院的正常妊娠女性30例設(shè)為健康組，檢測兩組MTHFR基因多態(tài)性，主要使用技術(shù)為聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)（PCR-RFLP）。結(jié)果：URPL組TT基因型頻率為26.7%，比健康組10.0%更高;CC基因型頻率為20.0%，比健康組40.0%更低，比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）;兩組CT基因型頻率為53.3% vs 50.0%，比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。結(jié)論：MTHFR基因多態(tài)性密切關(guān)聯(lián)于URPL，T等位基因可能為遺傳易感因素之一。

【關(guān)鍵詞】MTHFR基因多態(tài)性;不明原因習(xí)慣性流產(chǎn);相關(guān)性

[中圖分類號]R714.21 ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A ? [文章編號]2096-5249（2020）15-000-02

習(xí)慣性流產(chǎn)即女性自然流產(chǎn)次數(shù)≥2次（或3次）者，其中孕周在12周以內(nèi)流產(chǎn)者占70%左右，被國際上稱作復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)，發(fā)生率為2%～5%左右[1]。有多種因素會導(dǎo)致自然流產(chǎn)，如感染、遺傳缺陷、子宮畸形、個人行為與環(huán)境、內(nèi)分泌或激素分泌異常、血栓形成傾向及自身免疫疾病等。習(xí)慣性流產(chǎn)夫婦開展各種檢查后仍無法明確流產(chǎn)病因者被稱作原因不明習(xí)慣性流產(chǎn)（URPL），占比為50%～75%[2]。當(dāng)前國內(nèi)外均報道了亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）多態(tài)性與URPL的關(guān)系。MTHFR作為關(guān)鍵酶主要經(jīng)同型半胱氨酸（Hcy）和葉酸代謝，其功能在于不可逆還原5，10-亞甲基四氫葉酸至5-甲基四氫葉酸，密切關(guān)聯(lián)于DNA合成與甲基化。當(dāng)前已經(jīng)明確MTHFR基因多態(tài)性中C677T會降低MTHFR活性，阻礙Hcy向甲硫氨酸轉(zhuǎn)變，誘發(fā)高同型半胱氨酸血癥并降低葉酸水平，導(dǎo)致妊娠期胎盤形成血栓風(fēng)險增加，導(dǎo)致胚胎停育、胎盤栓塞等，最終誘發(fā)習(xí)慣性流產(chǎn)。現(xiàn)選取URPL患者與正常妊娠女性各30例，探討MTHFR基因多態(tài)性與URPL的關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1一般資料 本次納入對象為我院婦產(chǎn)科2018年11月～2019年4月收治的URPL患者30例，早期妊娠習(xí)慣性流產(chǎn)史≥3次，夫婦雙方外周血染色體核型均無異常，均無家族遺傳病史;經(jīng)子宮輸卵管造影、婦科及B超等檢查明確無生殖器解剖畸形;內(nèi)分泌功能無異常，B超對排卵情況予以監(jiān)測無異常，月經(jīng)周期無異常，基礎(chǔ)體溫為雙相，排除內(nèi)分泌病史如甲狀腺功能亢進(jìn)及糖尿病史者;弓形蟲病原或巨細(xì)胞病毒檢查結(jié)果為陰性者;抗磷脂抗體及抗核可抽提抗原抗體檢查連續(xù)超過3次，每次間隔超過4周結(jié)果均為陰性;規(guī)律生活，無藥物濫用、抽煙及酗酒史。30例患者年齡為22～37歲，平均年齡為（28.6±4.7）歲;妊娠時間為32～100d，平均妊娠時間為（53.7±6.4）d;選取同期于我院婦產(chǎn)科住院的正常妊娠女性30例設(shè)為健康組，年齡為21～36歲，平均年齡為（27.4±3.6）歲;妊娠時間為34～104d，平均妊娠時間為（55.8±7.2）d。兩組對象一般資料比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），具有可比性。

1.2一般方法 采集兩組空腹?fàn)顟B(tài)下肘靜脈血，行抗凝處理，使用0.2%EDTA，將血細(xì)胞DNA提取出來。先使用低滲溶血法將白細(xì)胞分離出來，氯、酚法將人基因組DNA提取出來。使用（PCR-RFLP）技術(shù)檢測兩組MTHFR基因多態(tài)性，合成擴(kuò)增的引物序列如下：P1： 5'-CAAAGGCCACCCCGAAGG-3'，反義為5'-AG-GACGGTCCGGTGAGAGTG-3'。25μl為PCR反應(yīng)體系總體積，10×Buffer，引物為0.3μmol/LMG2+，模板DNA為0.1μg，dNTPs為200μmol/L，aq酶為1UT，0.25μmol/LMG2+;5min、94℃為預(yù)變性參數(shù)，1min、94℃為變性參數(shù)，1min、57℃為復(fù)性參數(shù)，1min、72℃為延伸參數(shù)，循環(huán)35次后再次設(shè)定7min、72℃為延伸參數(shù)。對PCR產(chǎn)物予以觀察，使用2%瓊脂糖凝膠電泳，將10μlPCR產(chǎn)物取出，添加2μl10×Buffer與10UHinf I酶，補(bǔ)水后使產(chǎn)物達(dá)到20μl，持續(xù)消化16h并控制溫度為37℃，結(jié)果使用2.5%瓊脂糖膠電泳觀察。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 對本組獲取的數(shù)據(jù)開展統(tǒng)計學(xué)處理，應(yīng)用SPSS21.0軟件，計數(shù)資料表示方法為n（%），卡方檢驗χ2開展組間對比，若P<0.05提示比較有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

兩組MTHFR基因型頻率比較246bp為擴(kuò)增PCR結(jié)果片段長度，使用HinFI酶切消化該產(chǎn)物，會形成MTHFR基因型，共3種，包括雜合子型CT、純合突變型TT及野生型CC，246bp中包含C等位基因者HinfI不可消化，而含T等位基因者則被消化為72BP與174BP。兩組MTHFR基因型頻率、等位基因頻率比較如表1所示。

3 討論

URPL有復(fù)雜的發(fā)生機(jī)制，當(dāng)前各種相應(yīng)治療方案均無確切療效，婦產(chǎn)科一直將其作為疑難問題。人類基因組計劃全部完成，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)開始思考人類疾病發(fā)生發(fā)展可能關(guān)聯(lián)于基因，故而可淺顯地認(rèn)為人類所有疾病均屬于基因型。近年來臨床對URPL免疫遺傳學(xué)病因的研究報道逐漸增加且成為關(guān)注熱點，并從傳統(tǒng)遺傳模式角度向探索易感基因與易感染色體角度轉(zhuǎn)變。

MTHFR基因主要在染色體1P36.3處定位，外顯子共11個，5-甲基四氫葉酸為活化葉酸，轉(zhuǎn)化甲基為半胱氨酸后將蛋氨酸生成，進(jìn)而對蛋氨酸-半胱氨酸代謝予以調(diào)節(jié)。MTHFR酶依賴葉酸，存在遺傳突變性，當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的主要突變位點為MTHFR677C→T，其多態(tài)會將酶熱不穩(wěn)定性增加。本組選取的患者均排除其他會導(dǎo)致習(xí)慣性流產(chǎn)的因素，發(fā)現(xiàn)TT基因型頻率為26.7%，比健康組10.0%更高，說明TT型基因可能為獨立預(yù)測因素。綜合而言，MTHFR基因突變誘發(fā)URPL的機(jī)制可能如下：MTHFR基因密切關(guān)聯(lián)于5-甲基四氫葉酸，而該因子屬于甲基供體在機(jī)體核酸、嘧啶及嘌呤等因子代謝中均有所參與。因胎盤中缺少MTHFR活力，致使機(jī)體蛋白質(zhì)與DNA甲基化缺少，此為胚胎發(fā)育必要因子，故而導(dǎo)致流產(chǎn)、胚胎停育，同時還會將半胱氨酸濃度增加，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞并產(chǎn)生毒性，將血小板聚集與黏附增強(qiáng)，誘發(fā)胎盤血管栓塞性病變，這是重復(fù)性URPL與神經(jīng)管缺陷的主要危險因素[3]。另一方面，MTHFR基因突變降低酶的活力，影響機(jī)體營養(yǎng)、遺傳等因素。高半胱氨酸血癥為主要遺傳因素之一，作為已知的風(fēng)險因子會導(dǎo)致白種人形成動靜脈血栓。MTHFR677C→T為常見的遺傳缺陷，該突變導(dǎo)致酶蛋白中丙氨酸被絡(luò)氨酸取代，并使MTHFR形成46℃不耐熱的變異，誘發(fā)高半胱氨酸血癥后導(dǎo)致胎盤栓塞誘發(fā)流產(chǎn)[4]。此外，半胱氨酸會毒性作用于胚胎，在神經(jīng)胚胎形成期其損害致畸作用突出。另有研究表明[5]胎兒MTHFR基因突變也會增加自然流產(chǎn)風(fēng)險，說明習(xí)慣性流產(chǎn)可能關(guān)聯(lián)于母胎雙方基因型異同，若均為純合677T等位基因型則有更高的自然流產(chǎn)發(fā)生率。臨床已經(jīng)證實葉酸的攝取量為MTHFR基因突變主要營養(yǎng)因素，因此妊娠婦女一定要對葉酸予以適當(dāng)補(bǔ)充，還可選擇維生素B12及B6，實用且經(jīng)濟(jì)。

綜上所述，MTHFR基因多態(tài)性密切關(guān)聯(lián)于URPL，T等位基因可能為遺傳易感因素之一。

參考文獻(xiàn)

[1] 黃山鷹， 唐國玲， 劉慶芝， 等. MTHFR的基因多態(tài)性與原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性分析[J]. 國際生殖健康/計劃生育雜志， 2017， 36（5）： 382-384.

[2] 李乾， 常亮， 劉平， 等. 母胎亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T多態(tài)性與不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)發(fā)生風(fēng)險的相關(guān)性研究[J]. 生殖醫(yī)學(xué)雜志， 2018， 27（10）： 981-985.

[3] 郭謙楠， 馮戰(zhàn)啟， 康冰， 等. 河南漢族父親MTHFR基因?qū)δ赣H不明原因反復(fù)自然流產(chǎn)的影響[J]. 重慶醫(yī)學(xué)， 2016， 45（13）： 1736-1739.

[4] 肖海， 婁桂予， 張倩， 等. 不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者HVEM基因多態(tài)性檢測研究[J]. 重慶醫(yī)學(xué)， 2019， 48（16）： 2808-2810.

[5] 郭春燕， 艾紅梅. 雌激素受體β基因多態(tài)性和不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)系探討[J]. 實用婦產(chǎn)科雜志， 2018， 34（4）： 272-276.