基于碳納米管信號放大的卡那霉素高靈敏分析方法的建立

韋達理， 曾 昆*， 康啟鑫， 黃 哲， 張旭蕓

（1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全環(huán)境因子控制重點實驗室，天津300191；2. 江蘇大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013）

氨基糖苷類抗生素主要包括卡那霉素、 鏈霉素、慶大霉素等[1]，其中卡那霉素具有良好的抗菌性[2]，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，畜牧業(yè)，水產(chǎn)業(yè)以及醫(yī)藥行業(yè)[3]。 然而卡那霉素對耳、腎等比較敏感和脆弱的部位有明顯的毒性，易引起過敏反應(yīng)，還會導(dǎo)致耐藥菌的出現(xiàn)，加大治療難度[4]。 歐盟規(guī)定牛奶中卡那霉素最高殘留限量（Maximum Residue Limit，MRL）為150 ng/mL[5]，因此檢測食品中卡那霉素的殘留很有必要。

目前， 在抗生素和卡那霉素的檢測方法方面，主要集中為高效液相色譜法 （High-Performance liquid Chromatography，HPLC）[6-7]、液相色譜法（Liquid Chromatography，LC）[8-10]、 毛細(xì)管電泳法（Capillary Electrophoresis，CE）[11-13]、微生物抑制法[14-16]和 免疫 分析方法[17-18]等。 然而這些方法存在儀器昂貴，操作復(fù)雜，靈敏度較低等不足，無法滿足檢測要求[19]。 而免疫分析方法因其具備快速、簡便、高通量等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于檢測領(lǐng)域[20]。 目前，電化學(xué)分析方法發(fā)展迅速，已有基于電化學(xué)方法檢測卡那霉素的報道[21-24]。

近年來，許多新型納米材料以及其特性被不斷發(fā)掘，并成功應(yīng)用于物理、化學(xué)和材料等領(lǐng)域。 納米材料因其具有尺寸較小，比表面大等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于免疫分析方法中。 如膠體金、碳納米管、磁性微球、乳膠微球等在檢測領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[25-28]。 作者經(jīng)過小鼠免疫，血清測定，細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞篩選等步驟成功制備得到卡那霉素單克隆抗體，并引入碳納米管（Carbon Nanotube）多酶探針，建立了檢測食品中卡那霉素殘留的分析方法，并成功應(yīng)用于牛奶樣本的檢測中，為開發(fā)簡便快速、高靈敏的食品檢測免疫分析方法提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硫 酸 卡 那 霉 素 （Kanamycin）、 慶 大 霉 素（Gentamicin）、鏈霉素（Streptomycin）：購自中國藥檢所； 羊抗鼠酶標(biāo)二抗： 購自美國Jacket 公司；EDC·HCl、明膠和3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（3，3'，5，5'-Tetramethylbenzidine，TMB） 購自美國Sigma 公司；NaHCO3、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、NaCl、KCl、Tween-20、H2SO4、DMSO、H2O2：購自國藥集團；卡那霉素單克隆抗體：作者所在實驗室制備[31]。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀Infinite M1000 PRO： 奧地利Infinite 公司產(chǎn)品； 磁力攪拌器C-MAG HS4： 德國IKA 公司產(chǎn)品； 低溫高速離心機5415D： 德國Eppendorf 公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 卡那霉素間接競爭性ELISA 方法的建立

1） 抗原和抗體的最適工作濃度的優(yōu)化 首先在96 孔板中進行包被操作， 用包被液將包被原稀釋 成4個 質(zhì) 量 濃 度 梯 度， 分 別 為1、0.5、0.25、0.125 μg/mL，4 ℃過夜；第二天倒去酶標(biāo)板中液體，用PBST 進行洗滌操作， 備用； 然后進行封閉操作（2%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的明膠加入包被液中）， 在37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)1.5 h 后備用；隨后加入抗體，用抗稀將抗體也稀釋成4個質(zhì)量濃度梯度， 分別為0.4、0.2、0.1、0.05 μg/mL 并加入酶標(biāo)板中， 加入體積為50 mL，同時加入50 mL 的PBS 緩沖液，并進行兩次重復(fù)實驗，在37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)1 h；去除反應(yīng)液，用PBST 進行洗滌操作，備用；隨后用抗稀將酶標(biāo)二抗稀釋5000 倍后加入酶標(biāo)板中， 體積為100 mL，在37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)30 min； 隨后倒去反應(yīng)后的二抗溶液，用PBST 洗滌備用；然后加入TMB 顯色液，在37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)10～15 min；最后加入體積為50 mL 的硫酸終止液進行終止，孔板中的溶液由藍(lán)色變成黃色，同時在450 nm 處測其吸光度值。

2） 間接競爭性ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用包被液將KAN-OVA 稀釋至優(yōu)化后的質(zhì)量濃度，100 mL 體積加入酶標(biāo)板中，4 ℃過夜；隨后用PBST進行洗滌操作，備用；然后進行封閉操作（2%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的明膠加入包被液中）， 在37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)1.5 h，倒去封閉液后備用；加入稀釋后的抗體，同時加入稀釋成不同質(zhì)量濃度梯度的卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品，進行3次重復(fù)實驗， 在37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)1 h；倒去反應(yīng)液，用PBST 進行洗滌備用；隨后用抗稀將酶標(biāo)二抗稀釋5000 倍后加入酶標(biāo)板中，100 mL，在37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)30 min；隨后去掉反應(yīng)后的二抗溶液，用PBST 進行洗滌備用；然后加入TMB 顯色液，在37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)10～15 min；最后加入體積為50 mL 的硫酸終止液進行終止， 孔板中的溶液由藍(lán)色變成黃色， 同時在450 nm 處測其吸光度值； 使用Origin 繪圖軟件繪制卡那霉素的間接競爭抑制曲線。

1.3.2 卡那霉素單克隆抗體的純化采用試劑盒對制備所得的抗體進行純化，步驟如下：首先將平衡緩沖液（20 mmol/L PBS，pH 7.4）加入層析柱中，等待其自由流出，當(dāng)之后的流出液和之前所加入的PBS 平衡液一致時則停止； 然后用平衡緩沖液將腹水樣品按體積比1∶1 進行稀釋后， 將混合溶液慢慢滴加到純化柱中，等待上樣完畢后，繼續(xù)用平衡緩沖液進行洗滌， 待之后的流出液和之前所加入的PBS 平衡液一致時則停止； 用洗脫緩沖液（CH3COONa，pH 2.0）洗脫，同時收集洗脫液，并用配置好的碳酸鈉溶液（1 mol/L）調(diào)節(jié)所收集到液體的pH 值，保持抗體的活性（pH 值為中性），最后測定純化后抗體的質(zhì)量濃度。

1.3.3 MWCNTs-Abs-HRP 多酶探針的合成稱取羧基化后的MWCNTs 0.25 mg 至離心管中， 加入250 μL 的雙蒸水， 隨后使用超聲波清洗器將MWCNTs 成功分散于水溶液中， 備用； 隨后加入150 μL EDC，150 μL NHS，450 μL MES， 混合攪拌30 min；然后13000 r/min 離心10 min，洗去多余的EDC 和NHS；隨后加入1 mL MES 溶液并超聲使其重懸， 加入3.1 mg EDC，1.8 mg NHS，0.5 mg NH2-PEG-COOH，混合攪拌2 h 13000 r/min，離心10 min，洗去多余的EDC，NHS 和NH2-PEG-COOH；隨后加入1 mL MES 溶液并超聲使其重懸， 加入卡那霉素抗體（1 mg/mL）和HRP（1 mg/mL），4 ℃混合攪拌2 h；13000 r/min 狀態(tài)下進行離心操作，去上清取沉淀， 隨后將沉淀重懸于1 mL 2% 質(zhì)量分?jǐn)?shù)BSA的PBS 溶液，并且4 ℃保存。 并通過ELISA 方法對其進行表征。

1.3.4 基于MWCNTs-Abs-HRP 卡那霉素直接競爭性ELISA 方法的建立

1）基于MWCNTs-Abs-HRP 直接競爭性ELISA方法的檢測流程 首先進行包被，4 ℃過夜；隨后用PBST 洗滌備用；然后進行封閉操作（質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的明膠加入包被液中），在37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)1.5 h，去除封閉液后備用； 隨后加入稀釋后的MWCNTs-Abs-HRP 多酶探針（50 μL），以及不同質(zhì)量濃度的卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品（50 μL），每個質(zhì)量濃度設(shè)置3個平行， 在37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)1 h； 倒去反應(yīng)液，用PBST 洗滌備用；每孔加入100 μL 的TMB 顯色液，在37 ℃孵育10 min； 每孔加入50 μL 2 mol/L 的硫酸溶液；450 nm 吸光度條件下測其OD 值； 使用Origin 繪圖軟件繪制卡那霉素的間接競爭抑制曲線。

2）反應(yīng)條件的優(yōu)化 濃度：分別配制0、0.8、2、5 mol/L 的PBS 緩沖液， 用其稀釋卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，依照1.3.4.1 節(jié)的步驟進行重新測定，并選擇出最佳離子濃度；pH 值：分別配制pH 為5.5、7.4、8.6、10.0 的PBS 緩沖液， 用其稀釋卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，依照1.3.4.1 節(jié)的步驟進行重新測定，并選擇出最佳pH 值；Tween-20 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)： 分別配制Tween-20質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、0.05 %、0.1 %、0.2 %的PBS 緩沖液，用其稀釋卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液， 依照1.3.4 的步驟進行重新測定，并選擇出最佳Tween-20 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)：分別配制蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、0.1 %、0.5 %、1 %的PBS 緩沖液， 用其稀釋卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，依照1.3.4 的步驟進行重新測定，并選擇出最佳蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

3）直接競爭性標(biāo)準(zhǔn)曲線 基于1.3.4 中優(yōu)化后的條件，按照1.3.4 中的操作流程，卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì) 量 濃 度 為0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3 ng/mL，建立吸光度值隨標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度變化的抑制趨勢，并進行曲線擬合，最終得到半數(shù)抑制濃度（IC50），最低檢測限（IC90）和檢測范圍（IC20～IC80）。

4） 方法的特異性分析 將卡那霉素及其結(jié)構(gòu)類似物用PBS 稀釋成系列濃度，隨后進行交叉反應(yīng)率的測定。 根據(jù)測定結(jié)果測定不同物質(zhì)的IC50值。根據(jù)公式 （1） 計算各結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率（CR）。

1.3.5 牛奶樣品中卡那霉素殘留的檢測將純牛奶樣本用PBS（0.1 mol/L，pH 7.4）稀釋為不同比例，按照1.3.4 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，評估牛奶的基質(zhì)效應(yīng)。 將純牛奶樣本用PBS 稀釋到方法1.3.5 所測得的合適質(zhì)量濃度，然后添加4 中不同質(zhì)量濃度的卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品，分別為0、0.5、2 和10 ng/mL。用已經(jīng)建立好的檢測方法進行卡那霉素質(zhì)量濃度的檢測，計算加標(biāo)回收率。 從本地選購了6種不同品牌的純牛奶樣本，并用新建立的檢測方法對牛奶中的卡那霉素質(zhì)量濃度進行測定。采用UPLC-MS/MS 方法對牛奶樣本中卡那霉素進行測定[33]。

2 結(jié)果與討論

2.1 卡那霉素間接競爭性ELISA 的建立

為獲得最好靈敏度的檢測方法，首先對抗原和抗體的最適質(zhì)量濃度進行了優(yōu)化。 結(jié)果如表1 所示。當(dāng)OD450nm值在1.0～1.5 左右時，能夠使實驗具有更高的靈敏度；同時發(fā)現(xiàn)包被原和抗體的質(zhì)量濃度較高都會對ELISA 體系的靈敏度產(chǎn)生影響，但是包被原對靈敏度的影響更大，所以作者選擇抗體的最適質(zhì)量濃度為0.2 μg/mL，KAN-OVA 的最適質(zhì)量濃度為0.25 μg/mL，此時的OD450nm值為1.385。

根據(jù)以上獲得的最適的工作質(zhì)量濃度，繪制檢測卡那霉素的ELISA 檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。根據(jù)擬合的最終結(jié)果所得LOD 為0.295 ng/mL，IC50為4.826 ng/mL，IC20～IC80為0.946～24.627 ng/mL。

表1 方陣滴定法確定質(zhì)量濃度Table 1 Checkerboard for the optimal concentration of antibody and antigen

圖1 卡那霉素ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve of ELISA for kanamycin

2.2 MWCNTs-Abs-HRP 的表征

為了表明多酶探針的成功合成， 需要對MWCNTs-Abs-HRP 多酶探針上的Ab 和HRP 進行驗證。 首先用顯色法驗證多酶探針上的信號分子HRP， 如圖2 和圖3 所示， 未修飾的碳納米管和TMB-H2O2并未發(fā)生顯色反應(yīng)， 而MWCNTs-Abs-HRP 多酶探針和TMB-H2O2能夠發(fā)生顯色反應(yīng)，則表明信號分子成功偶連到碳納米管上。 具體的操作步驟參考1.3.4.1 節(jié)中的操作流程，卡那霉素的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度設(shè)置4個梯度100、10、1、0 ng/mL，由于多酶探針上Ab 的存在，導(dǎo)致顯色結(jié)果的不同，出現(xiàn)抑制趨勢。 由此可以判定多酶探針MWCNTs-Abs-HRP 的成功合成。

在免疫分析實驗中， 抗體作為結(jié)合分子，而HRP 作為信號分子，兩者都與檢測的靈敏度緊密聯(lián)系。 為了能夠得到最好的檢測靈敏度，所以需要對探針上抗體和HRP 的量進行優(yōu)化，尋找到最好的比例。如表3 所示。當(dāng)C（Ab）∶C（HRP）=1∶4，A450nm值最高，并且此時的IC50也是最低的，具有最高的靈敏度。

圖2 MWCNTs-Abs-HRP 多酶探針的驗證Fig. 2 Identification of latex MWCNTs-Abs-HRP with centrifugation method

圖3 最適抗體和HRP 比例的優(yōu)化Fig. 3 Optimization of the ratio of antibody and HRP

2.3 基于MWCNTs-Abs-HRP 直接競爭性ELISA 方法條件優(yōu)化

抗原抗體的結(jié)合容易受到溶液理化條件的影響，包括離子強度、pH 以及蛋白質(zhì)含量。 同時在實驗中發(fā)現(xiàn)，合成后MWCNTs 容易沉淀，為使其更好的懸浮于溶液中參與抗原抗體反應(yīng)，需要添加一定的表面活性劑。如圖4 所示，基于靈敏度高和A0/IC50高的選擇要求， 最終確定的最優(yōu)的緩沖液條件為0.8 mol/L PBS，pH 7.4，含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05% Tween-20 和1% BSA。

圖4 基于MWCNTs-Abs-HRP 直接競爭性ELISA 的條件優(yōu)化Fig. 4 Optimization of direct competitive ELISA based on MWCNTs-Abs-HRP

2.4 基于 MWCNTs-Abs-HRP 直接競爭性ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線

為提高免疫分析方法的靈敏度，許多研究集中于探索不同的信號放大模式，其中可以納米材料為載體構(gòu)建多酶納米顆粒作為信號分子。 借助納米材料的高比表面積特性，結(jié)合更多的信號分子，達到信號放大進而提高方法靈敏度的效果。 江羚[31]等以納米金顆粒為載體，合成AuNPs/HRP-Kan，建立了增強型直接競爭性ELISA 方法， 其最低檢測限從0.13 ng/mL 提高到0.022 ng/mL。 Zhang[34]等采用CNTs 連 接HRP， 構(gòu) 建 檢 測Ataxia Telangiectasia Mutated（ATM）的免疫分析方法，檢測限從1 ng/mL提高到0.2 pg/mL。

根據(jù)以上所得的最適條件，得到新檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖5。相較于之前所建立的卡那霉素ELISA 方法，靈敏度提高了約5 倍，該方法操作流程簡單，縮減了反應(yīng)時間，更加便捷、方便。

圖5 基于碳納米管高靈敏免疫新方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 5 Standard curve of high sensitivity ELISA based on carbon nanotubes

2.5 基于MWCNTs-Abs-HRP 直接競爭性新方法的重復(fù)性

為了驗證此方法的重復(fù)性，進行了批內(nèi)差和批間差的測定。 首先進行批內(nèi)差測定，進行6個平行實驗，并計算標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和變異系數(shù)（CV）。 由表2 批內(nèi)差數(shù)據(jù)可得， 基于碳納米管信號放大的新方法的變異系數(shù)介于0.47%～4.69%之間，變異系數(shù)小于15%。 隨后進行了批間差的測定，在不同的時間進行標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，并計算標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和變異系數(shù)（CV）。 新方法的變異系數(shù)介于4.10%～9.98%。實驗結(jié)果表明該方法的批內(nèi)差和批間差都小于15%， 此方法可用于環(huán)境樣本中卡那霉素的殘留檢測。

表2 基于MWCNTs-Abs-HRP 新方法的重復(fù)性驗證Table 2 Repeatability verification of the new method based on MWCNTs-Abs-HRP

2.6 交叉反應(yīng)率的測定

選擇了5種氨基糖苷類抗生素， 通過ELISA 方法測定其交叉反應(yīng)率。 結(jié)果如表3 所示。 從表中的計算結(jié)果可知：卡那霉素單克隆抗體能夠特異性地識別卡那霉素，但是與妥布霉素具有很高的交叉反應(yīng)率（82.82 %），與其他氨基糖苷類抗生素的交叉反應(yīng)可忽略不計（＜0.01%）。 Chen[35]等也報道了類似的結(jié)果，其中與Tob 的交叉反應(yīng)率為90%。 根據(jù)Chen等的分子模型，Kan 和Tob 的結(jié)構(gòu)幾乎相同，包含3個環(huán)結(jié)構(gòu)。 一個環(huán)中只有兩個不同取代基可以區(qū)分這兩種抗生素，這兩個取代基分別是Kan 的羥基和Tob 的氨基和氫。 卡那霉素抗體主要與另外兩個環(huán)結(jié)合， 這兩個環(huán)代表了Kan 和Tob 的共同結(jié)構(gòu)，因此卡那霉素單克隆抗體與妥布霉素具有很高的交叉反應(yīng)率。

表3 交叉反應(yīng)率測定Table 3 Determination of the cross-reactivity

2.7 牛奶的基質(zhì)效應(yīng)的測定

由于純牛奶樣本中蛋白質(zhì)含量很高且成分較為復(fù)雜， 因此會影響抗原和抗體的特異性結(jié)合，同時也會影響整個檢測方法的靈敏度。 所以在將此方法應(yīng)用于牛奶檢測之前，先測定其基質(zhì)效應(yīng)對此方法的影響。 如圖6 所示， 未稀釋的牛奶以及稀釋2倍的牛奶樣本在構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線時， 吸光度值與在PBS 緩沖液反應(yīng)中的有很大差異， 所以導(dǎo)致靈敏度降低。 當(dāng)牛奶樣本稀釋到4 倍或者8 倍時，吸光度值與對照組基本保持一致，同時抑制趨勢也基本一致。 因此，在檢測牛奶樣本時用PBS 稀釋4 倍以后進行測定。

測定添加回收率的目的就是為了驗證作者所建立的檢測方法的可行性和準(zhǔn)確性。 由表4 的結(jié)果可得，牛奶中加標(biāo)回收率為99.6%～114.8%，可見回收率在80%～120%之間，表明實驗的可行性和準(zhǔn)確性都很好。

從本地超市中購買6種不同品牌的純牛奶，并用建立的ELISA 分析方法對卡那霉素含量進行測定，并用UPLC-MS/MS 對方法進行校正。 從表5 可以看出，采用建立的ELISA 方法檢測出有兩種牛奶中含有卡那霉素，最高為0.124 ng/mL，但遠(yuǎn)低于歐盟規(guī)定的MRL（150 ng/mL）。 與此同時，也采用了儀器方法（UPLC-MS/MS）對相同的樣本進行測定，并比較兩者的檢測結(jié)果。 由表4 中的數(shù)據(jù)可得，兩種分析方法（ELISA 方法和UPLC-MS/MS 法）的檢測結(jié)果具有良好的相關(guān)性，可認(rèn)為此方法是可行的。

圖6 牛奶樣本基質(zhì)效應(yīng)的測定Fig. 6 Matrix effect in milk samples

表4 樣品加標(biāo)回收率及變異系數(shù)測定Table 4 Recovery and CV of Kanamycin in milk samples

表5 實際牛奶樣品中卡那霉素的殘留檢測Table 5 Determination of Kanamycin in milk samples

3 結(jié) 語

該方法應(yīng)用于牛奶樣本中卡那霉素的檢測，6種本地牛奶樣本中檢測到2種含有卡那霉素，但含量遠(yuǎn)低于MRL。

作者以MWCNTs 為載體，成功合成多酶納米顆粒MWCNTs-Abs-HRP。 構(gòu)建基于MWCNTs-Abs-HRP 的直接競爭ELISA 方法，其質(zhì)量濃度線性范圍為0.151～5.161 ng/mL， 其最低檢測限為0.061 ng/mL，相比常規(guī)間接競爭性ELISA，靈敏度提高約5 倍。