阿拉善雙峰駝酸駝乳中乳酸菌的分離鑒定及耐酸和耐鹽研究

FAHAD Shah，徐鴻洋，智超，宮海萌，張和平，趙國(guó)芬，*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010011；2.江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇無錫214122）

駝奶營(yíng)養(yǎng)成分豐富[1-3]，有一定的保健功效，在糖尿病、肺結(jié)核、肝炎、貧血、食物過敏反應(yīng)和消化道疾病等的治療中有改善作用[4-6]。而酸駝乳風(fēng)味濃郁，口感醇厚，極具民族特色，除了具有駝奶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值外，還有一定的抗菌和益生特點(diǎn)，是一個(gè)極具市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的新產(chǎn)品。其中微生物菌系十分復(fù)雜，含有豐富的對(duì)人體有益生作用的乳酸菌及酵母菌資源。而不同地域的酸駝乳中的乳酸菌種類和數(shù)量又存在特別大的差異[7-10]，因此其風(fēng)味也有所差異。但目前有關(guān)酸駝乳的研究甚少，酸駝乳的工業(yè)化生產(chǎn)急需開發(fā)其中的微生物資源。

阿拉善盟雙峰駝是內(nèi)蒙古自治區(qū)的特色動(dòng)物，駝產(chǎn)業(yè)是阿拉善地區(qū)的支柱產(chǎn)業(yè)，駝奶資源豐富，本研究旨在充分利用好地區(qū)資源并結(jié)合產(chǎn)業(yè)優(yōu)勢(shì)，以開發(fā)傳統(tǒng)發(fā)酵酸駝乳中的乳酸菌資源，生產(chǎn)自主研發(fā)的、風(fēng)味獨(dú)特酸駝奶制品為宗旨，從傳統(tǒng)發(fā)酵酸駝乳中分離優(yōu)勢(shì)乳酸菌并進(jìn)行鑒定、耐酸性和耐鹽性研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)原料

酸駝乳（ASR）、鮮駝乳（AXR）、馬奶：來自內(nèi)蒙古阿拉善地區(qū)牧民家中經(jīng)過傳統(tǒng)發(fā)酵、巴氏消毒。酸駝乳傳統(tǒng)發(fā)酵數(shù)天放置于密封塑料壺中冷凍保存運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室，與鮮駝奶一起置于4℃冰箱中暫時(shí)保存。

1.1.2 試劑

TaqDNA聚合酶、2×PCRmix、溶菌酶（20000U/mg）、蛋白酶K（≥40 U/mg protein）：大連寶生物工程有限公司；引物（7F/1540R）、dNTP Mix：天根生化科技有限公司。

無水乙醇、異丙醇、氯化鈉、D（+）-無水葡萄糖、檸檬酸銨、蛋白胨、瓊脂、牛肉浸粉、酵母提取粉、硫酸錳、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、硫酸鎂、吐溫-80：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要設(shè)備

TG16-W微量高速離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；THZ-100B恒溫培養(yǎng)搖床：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；E1509020紫外可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；DYY-10C型核酸電泳儀：北京市六一儀器廠；Ver Sa Doc2000凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司；LD2X-30KA立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；徠卡DMLB型顯微鏡：德國(guó)徠卡顯微鏡與系統(tǒng)公司；DELTA320 pH計(jì)：METTLER TOLEDO。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

按微生物學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)的方法配制[11]。

1.2.2 酸駝奶樣品的梯度稀釋、pH值測(cè)定與涂布培養(yǎng)

將從阿拉善牧人家獲取的1份傳統(tǒng)發(fā)酵的阿拉善雙峰駝酸駝奶樣品用pH計(jì)測(cè)定pH值，測(cè)定3次，取平均值。按照表1的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分然后將稀釋到10-5的酸駝奶樣品涂布在普通MRS固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)[12]。將長(zhǎng)出的的單菌落刮取一定量，在MRS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線純化4次，將分離純化得到的疑似乳酸菌進(jìn)行感官評(píng)定和革蘭氏染色分析形態(tài)[13]。

表1 感官評(píng)定評(píng)分表Table 1 Sensory assessment scale

1.2.3 基于16 SrDNA疑似乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定

利用細(xì)菌基因組提取試劑盒分別對(duì)分離純化的疑似乳酸菌菌液提取基因組，利用7F/1540R引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增16 SrDNA片段[14]，然后將PCR產(chǎn)物電泳后回收，送由基因公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果用Blast與NCBI中的Gene Bank數(shù)據(jù)庫中近緣菌株的16 SrDNA進(jìn)行同源性比對(duì)，使用MEGA7軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，確定疑似菌株的分類地位。

1.2.4 乳酸菌在MRS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將鑒定為乳酸菌的菌株分別接種到液體MRS培養(yǎng)基中37℃進(jìn)行搖床培養(yǎng)，約4 h后按2%的體積比例接種到新的MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2 h測(cè)定OD600nm。

1.2.5 乳酸菌耐酸性、產(chǎn)酸性和最佳pH值的確定

按2%的體積比例接種已鑒定的乳酸菌菌液到pH值分別調(diào)為4.0、3.0、2.0和1.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)，測(cè)定12 h的OD600nm，以在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)為對(duì)照，分析各個(gè)菌株在不同pH值下的生長(zhǎng)情況及存活率，來判斷其耐酸性。

按2%的體積比例接種已鑒定的乳酸菌菌液到中性的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別測(cè)定12、24、48 h的pH值，判斷各個(gè)菌株的產(chǎn)酸性能。

將已鑒定的乳酸菌接種在MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，取活化好的菌株以3%體積比的接種量分別接種到 pH 值分別為 3.5、4.5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的 8種MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床中生長(zhǎng)24 h，測(cè)定OD600nm，確定其最佳pH值。

1.2.6 乳酸菌耐鹽性分析

按3%的體積比例分別接種乳酸菌菌液到NaCl濃度分別為2%、4%、6%和8%的液體MRS培養(yǎng)基中，每隔2 h測(cè)定一次OD600nm，判斷各菌對(duì)不同濃度的NaCl的耐受性。

1.2.7 乳酸菌對(duì)鮮馬奶和鮮駝奶反發(fā)酵試驗(yàn)

將已經(jīng)鑒定的乳酸菌菌液經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后以3%的體積比例分別接種到分裝好的已滅菌的鮮馬奶和鮮駝奶中35.5℃進(jìn)行發(fā)酵，分別測(cè)定發(fā)酵24、48、72 h的pH值，考察其發(fā)酵情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離鑒定

將3株乳酸菌提取基因組DNA后，用16 SrDNA引物擴(kuò)增16 SrDNA片段，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1，都有與16 SrDNA目的片段大小一致的條帶出現(xiàn)，說明16 SrDNA基因片段擴(kuò)增成功。

1號(hào)～3號(hào)乳酸桿菌的16 SrDNA基因片段構(gòu)建的進(jìn)化樹見圖2～圖4。

圖1 3株菌的16 SrDNA PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of 16 S rDNA PCR products of three strains of Lactobacillus

圖2 1號(hào)乳酸桿菌的16 SrDNA基因片段構(gòu)建的進(jìn)化樹Fig.2 Evolutionary tree by 16 SrDNA gene fragment of Lactobacillus No.1

圖3 2號(hào)乳酸桿菌的16 SrDNA基因片段構(gòu)建的進(jìn)化樹Fig.3 Evolutionary tree by 16 SrDNA gene fragment of Lactobacillus No.2

圖4 3號(hào)乳酸桿菌的16 SrDNA基因片段構(gòu)建的進(jìn)化樹Fig.4 Evolutionary tree by 16 SrDNA gene fragment of Lactobacillus No.3

傳統(tǒng)發(fā)酵阿拉善雙峰駝酸駝奶樣品的pH值為4.12～4.16，經(jīng)過感官評(píng)定，該酸駝奶樣品的評(píng)分結(jié)果為：色澤26分，較均勻、乳黃色；口感14分，純正；酸味15分，較酸；甜味8分，較淡；乳味13分，乳味很重。從中分離純化出3株乳酸菌，菌落清晰、均一明顯。顏色呈乳黃色，菌落相對(duì)較小、圓形、凸起，發(fā)出較濃酸味。菌體革蘭氏染色為陽性，呈短桿狀。

分別提取3株菌的DNA，用7 F/1540 R引物進(jìn)行16 S rDNA擴(kuò)增、電泳（圖1）和回收后測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在Gene Bank中進(jìn)行Blast，并使用MEGA7軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果如圖2～圖4。結(jié)果表明，1號(hào)菌、2號(hào)菌和3號(hào)菌分別為L(zhǎng)actobacillus plantarum strain KC28、Lactobacillus plantarum strain K25和Lactobacillus sp.D1501，與這3個(gè)菌株的16 SrDNA序列相似性分別為99.9%、99.9%和99.8%，均屬于植物乳酸桿菌屬。

2.2 乳酸菌在MRS液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

將已鑒定的3株乳酸菌分別在液體MRS液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，每2 h測(cè)定一次OD600nm繪制的生長(zhǎng)曲線如圖5。

圖5 3株乳酸菌的生長(zhǎng)曲線Fig.5 Curve of growth curve of three strain of Lactobacillus

3株菌均在4 h左右開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，11.5 h后基本達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)期穩(wěn)定期，一直持續(xù)到22 h左右，后逐漸進(jìn)入凋亡期。

2.3 乳酸菌耐酸性、產(chǎn)酸性和最佳pH值

為比較3個(gè)菌株的耐酸性，分別將3株乳酸菌在pH值分別為4.0、3.0、2.0和1.0的MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，以MRS培養(yǎng)基為對(duì)照，比較在不同pH值環(huán)境中的生存率，來反映其耐酸性強(qiáng)弱，結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同pH值下3株乳酸菌的存活率Fig.6 Survival rate of three strains of Lactobacillus at different pH

由圖6可知，1號(hào)、2號(hào)株菌在pH值大于3時(shí)存活率都在50%以上，pH值為3時(shí)，3號(hào)菌存活率為48.2%，說明3株菌的耐酸性都很好，且在pH值為1時(shí)仍然能生長(zhǎng)。pH值為2時(shí)，3株菌也可以生長(zhǎng)，只不過生長(zhǎng)速度下降了，說明3株菌均可以耐胃酸這樣的環(huán)境。若這些菌種用來發(fā)酵駝奶，利于其順利通過胃部進(jìn)入腸道在消化道中生存而發(fā)揮其益生活性。

培養(yǎng)液中的pH值可反映微生物生長(zhǎng)過程中的產(chǎn)酸性能。為了解3株菌的產(chǎn)酸性能，測(cè)定3株乳酸菌菌液分別在中性的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12、24、48 h的pH值，3株乳酸菌的產(chǎn)酸性能見圖7。

由圖7可知，3株菌均能產(chǎn)酸，培養(yǎng)基中pH值下降不大，且規(guī)律大致相同，產(chǎn)酸性能適中，不僅對(duì)成品酸駝乳的風(fēng)味有重要影響，也可有效防止雜菌污染。

圖7 3株乳酸菌的產(chǎn)酸性能Fig.7 Acid production performance of three strains of Lactobacillus

為了解乳酸菌培養(yǎng)的最適pH值將3株乳酸菌在不同pH值的MRS中培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD600nm，結(jié)果見圖8。

圖8 不同pH值下3株乳酸菌的生長(zhǎng)情況Fig.8 Growth of three strains of Lactobacillus at different pH value

結(jié)果表明3株菌的最適pH值均為6.5。耐酸微生物是指最適pH值接近中性時(shí)能生長(zhǎng)，而嗜酸微生物是指最適pH值小于3的微生物，所以，3株菌均屬于耐酸微生物，不屬于嗜酸微生物。

2.4 乳酸菌的耐鹽性

駝奶相對(duì)牛奶鹽度較高，對(duì)鹽度的耐受性反映乳酸菌可否在高鹽濃度下發(fā)酵駝奶并正常生存。3株乳酸菌對(duì)不同NaCl濃度耐受性情況如圖9所示。

圖9 3株乳酸菌對(duì)不同NaCl濃度的耐受力Fig.9 Tolerance of three strains of Lactobacillus to different NaCl concentrations

由圖9可知，含2%NaCl的MRS培養(yǎng)基中乳酸桿菌可以正常生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)規(guī)律與在MRS培養(yǎng)基中基本相似；在含4%NaCl的MRS培養(yǎng)基中，乳酸桿菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期被延遲，且未達(dá)到較高的菌體濃度，在達(dá)到相應(yīng)較高生長(zhǎng)濃度后受到抑制，劇烈下降后持續(xù)快速生長(zhǎng)，說明4%鹽濃度的耐受有一個(gè)適應(yīng)的過程；在含6%NaCl的MRS中，乳酸菌的延滯期和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期都得到延遲，而且生長(zhǎng)速度明顯變慢，出現(xiàn)了持續(xù)明顯的抑制現(xiàn)象；含8%NaCl的培養(yǎng)基中，乳酸菌生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，并且在生長(zhǎng)到6 h時(shí)急劇下降后又有明顯上升趨勢(shì)，但始終受到高濃度的NaCl的抑制，基本無法在此環(huán)境中正常生長(zhǎng)。耐鹽微生物能夠生長(zhǎng)在很廣的鹽濃度范圍內(nèi)，但最適宜其生長(zhǎng)的是在鹽濃度0.2 mol/L（即 2.9%）[15]。所以，3 株均為耐鹽微生物，這些耐鹽乳酸菌在駝奶發(fā)酵過程中使用，有助于改善酸駝奶風(fēng)味和防治雜菌感染。

2.5 乳酸菌可發(fā)酵鮮馬奶和鮮駝奶

測(cè)定了3株乳酸菌在35.5℃發(fā)酵鮮馬奶和鮮駝奶24、48、72 h的pH值，結(jié)果如表1和表2所示。

表2 乳酸菌發(fā)酵駝奶不同時(shí)間點(diǎn)的pH值Table 2 The pH value of lactic acid bacteria fermented camel milk at different time points

表3 乳酸菌發(fā)酵馬奶不同時(shí)間點(diǎn)的pH值Table 3 The pH value of lactic acid bacteria fermented horse milk at different time points

經(jīng)乳酸桿菌發(fā)酵而成的酸駝奶和酸馬奶在酸度上與天然發(fā)酵駝奶和馬奶非常接近，利用相同方法從中也可分離得到相應(yīng)乳酸菌；經(jīng)過感官評(píng)定也發(fā)現(xiàn)其口感與天然發(fā)酵酸駝奶和酸馬奶極其相似（天然酸駝奶的pH值為4.12～4.16，天然酸馬奶的pH值為3.80～4.20）。

3 結(jié)論

對(duì)來自阿拉善地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵的阿拉善雙峰駝酸駝乳中的乳酸菌進(jìn)行了分離鑒定及耐酸性和耐鹽性的研究結(jié)果表明，分離出3株乳酸菌，經(jīng)鑒定均為乳桿菌屬，分別是 Lactobacillus plantarum strain KC28、Lactobacillus plantarum strain K25和Lactobacillus sp.D1501，是阿拉善地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵的阿拉善雙峰駝酸駝乳中的優(yōu)勢(shì)菌。3株菌均為革蘭氏陽性，菌落均清晰、較小、圓形、凸起，發(fā)出較濃酸味，顏色呈乳黃色；耐酸性很好；產(chǎn)酸性能一般；最適pH值均為6.5；在不超過2%的鹽度下生長(zhǎng)不受影響，為耐鹽微生物。如果將分離菌株合理組合，會(huì)開發(fā)出生物學(xué)特性獨(dú)特、風(fēng)味優(yōu)良的駝奶發(fā)酵菌劑，并且有望在胃腸道環(huán)境中發(fā)揮重要生理作用。