MAE-HPLC-HG-AFS同時測定洛克沙砷及其8種代謝物

崔穎，姜濤，倪松，逯玉鳳

（1.天津海關(guān)動植物與食品檢測中心，天津300461；2.北京海光儀器有限公司，北京100015）

洛克沙砷（roxarsone，ROX）屬于有機砷類制劑，曾廣泛用作豬、雞的促生長劑，有預防疾病、促進生長、提高飼料利用率和改善肉的色澤等作用[1]。但是ROX進入動物體內(nèi)經(jīng)吸收、分布、代謝后，通過排泄物進入外界環(huán)境，如果在環(huán)境中進一步富集，通過食物鏈傳遞，最終會對人類構(gòu)成危害。2018年1月11日，我國農(nóng)業(yè)部《中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2638號》明確規(guī)定：為保障動物產(chǎn)品質(zhì)量安全，維護公共衛(wèi)生安全和生態(tài)安全，開展了風險評估和安全再評價。評價認為ROX的原料藥及各種制劑可能對動物產(chǎn)品質(zhì)量安全、公共衛(wèi)生安全和生態(tài)安全存在風險隱患。根據(jù)《獸藥管理條例》第六十九條規(guī)定，決定停止在食用動物中使用ROX。

受形態(tài)分析方法的限制，早期對ROX代謝研究工作主要集中在禽類的排泄物上。在雞的排泄物中ROX占主要成分[2-5]，動物體內(nèi)吸收較少，大多數(shù)隨糞便直接排出[6]。已有研究[7-12]在雞的組織樣品中發(fā)現(xiàn)了多種砷形態(tài)，包括砷甜菜堿（arsenobetaine，AsB）、亞砷酸鹽[arsenite，As（III）]、砷酸鹽[arsenate，As（V）]、一甲基砷酸（monomethyl arsenic，MMA）、二甲基砷酸（dimethyl arsenic dimethyl arsenic，DMA）、3-氨基-4-羥基苯胂酸（3-amino-4-hydroxybenzene arsenic acid，3-AHPAA）、4-氨基苯胂酸（4-aminophenylarsonic acid，4-APAA）、N-乙酰-4-羥基苯胂酸（N-acetyl-4-hydroxy-m-arsanilic acid，N-AHAA）、洛克沙砷（roxarsone，ROX）和一些未知形態(tài)[2，5，13-17]。

砷形態(tài)分析前處理方法應該既有良好的回收率又能保持砷在樣品中的原始形態(tài)[18]。按提取儀器不同，可分為萃取提取、振搖提取、離心提取、超聲輔助提取、微柱輔助提取和微波輔助提取等[19-23]；按提取液不同，可分為水提取、甲醇-水提取、氯仿-甲醇-水提取和酶提取等[24-25]。目前主要的檢測聯(lián)用技術(shù)有高效液相色譜與原子熒光光譜（atomic fluorescence spectrometry，AFS）[26]、電感耦合等離子體發(fā)射光譜（inductively coupledplas ma-atomic emission spectrometry，ICP-AES）[27-28]、電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）[9-10，29]等聯(lián)用。本研究運用微波輔助萃取-高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜（microwave assisted extraction-high performance liquid chromatography-hydride generation-atomic fluorescence spectrometry，MAE-HPLC-HG-AFS）聯(lián)用技術(shù)對動物樣品中ROX及其代謝物進行了同時檢測，可為ROX的代謝轉(zhuǎn)化及其代謝物在環(huán)境中累積和遷移的研究提供技術(shù)支撐，為研究動物對ROX代謝物的吸收累積以及毒性砷形態(tài)進入人體的途徑提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標準品與試劑

洛克沙砷（CAS 編號：121-19-7，C6H6AsNO6，純度≥97.5%）：ehrenstorfer gmbh公司；3-氨基-4-羥基苯胂酸（CAS 編號：2163-77-1，C6H8AsNO4，純度≥98.1%）：sigma aldrich公司；砷甜菜堿（CAS編號：64436-13-1，C5H11AsO2，純度≥98%）：tri chemical laboratories公司；4-氨基苯胂酸（CAS 編號：98-50-0，C6H8AsNO3，純度≥99%）、N-乙酰-4-羥基苯胂酸（CAS編號：97-44-9，C8H10AsNO5，純度≥98.1%）：pfaltz and bauer公司；亞砷酸根溶液標準物質(zhì)（Na3AsO3，GBW08666）、砷酸根溶液標準物質(zhì)（Na2HAsO4·12H2O，GBW08667）、一甲基砷酸溶液標準溶液（CH4AsNaO3·1.5H2O，GBW08668）、二甲基砷酸溶液標準溶液（C2H6AsNaO2·2H2O，GBW08669）：國家標準物質(zhì)中心。

甲醇（HPLC級）：德國Merck公司；鹽酸、硼氫化鉀、磷酸二氫鉀、過硫酸鉀（優(yōu)級純）：國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉（優(yōu)級純）：北京化工廠；四丁基溴化銨（優(yōu)級純）：天津光復精細化工研究所；三氟乙酸（優(yōu)級純）：上海天蓮精細化工有限公司。其他試劑均為分析純及以上。

1.2 儀器與設(shè)備

1260型號高效液相色譜儀（包括液相色譜泵和進樣裝置）：美國agilent公司；9560型原子熒光光譜儀：北京海光公司；multiwave PRO型微波消解系統(tǒng)：奧地利AntonPaar公司；T18組織勻漿機：德國IKA公司；Alpha 1-4/LD-plus型凍干機：德國 christ公司；Milli-Q reference型超純水儀：德國millipore公司；VORTEX型渦輪混合器：美國scientific industries公司；3-30K型高速冷凍離心機：美國sigma公司；N-EVAP-24型水浴氮吹儀：美國organomation associates Inc公司；PL303分析天平（Max=210 g，d=0.001 g）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SQP電子天平（Min=10mg，Max=220g，d=0.1mg）：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；濾膜（0.45 μm，直徑47 mm，有機系）：agela technologies公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 液相色譜參考條件

色譜柱：陰離子交換色譜柱PRP X-110S（7 μm，150 mm×4.10 mm，Hamilton）。流動相：（A）5%甲醇；（B）5%甲醇-60 mmol/L碳酸氫銨溶液，pH 8.75。流速：2.0 mL/min。洗脫程序：0～2 min，流動相A從100%線性遞減到50%，流動相B從0%線性遞增到50%；2 min～5 min，50%A 和 50%B；5 min ～8 min，流動相 B從50%遞增到100%；8 min～17 min，100%B；17 min～18 min，流動相B從100%線性遞減到0%，流動相A從0%遞增到100%；18 min～20 min，100%A。進樣體積：100 μL。

1.3.2 原子熒光檢測參考條件

負高壓：330 V；燈電流：100 mA；載氣流量：400 mL/min；屏蔽氣流量：900 mL/min；載流：7%HCl溶液；載流流速：110 r/min；還原劑：5 g/L KOH-20 g/L KBH4；還原劑流速：110 r/min；過硫酸鉀溶液濃度：3%；過硫酸鉀溶液流速：100 r/min；讀數(shù)模式：峰面積。

1.3.3 樣品處理方法

準確稱取1 g（精確到0.001 g）雞和豬組織勻漿于微波輔助萃取內(nèi)罐中，加10 mL甲醇-水提取液（1∶1，體積比），按照微波輔助萃取儀的操作步驟進行提取，提取溫度80℃，提取時間60 min。提取完畢，取出冷卻至24℃，10 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中。殘渣再加5 mL提取液于25 mL容量瓶中。重復“殘渣再加5 mL提取液，在渦旋混合器上充分混合，10 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中”操作一次。合并上清液于25 mL容量瓶中，定容。取10 mL上清液，氮氣吹掃，用提取液定容至2 mL，經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾，供HPLC-AFS測定。按同一操作方法作空白試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC-AFS試驗條件的確定

對9種砷形態(tài)進行分析，包括ROX和它可能的代謝產(chǎn)物，如3-AHPAA、4-APAA和N-AHAA以及一些常見的砷形態(tài)，如 As（III）、DMA、MMA、As（V）和 AsB。這9種砷形態(tài)用于建立砷形態(tài)分析方法。

2.1.1 高效液相色譜分離條件的確定

應用9種混合標準溶液優(yōu)化HPLC條件。在這9種砷形態(tài)中，有7種砷形態(tài)的酸度系數(shù)（protein kinase A，pKa值）低于7.0，在堿性條件下，它們會帶上負電荷。因此，這里選用了一種強陰離子交換柱（PRP X-110S）來實現(xiàn)對9種砷形態(tài)的分離?；趯PLC-AFS進樣的考慮，選用了碳酸氫銨溶液和5%甲醇作為流動相，適用于兩個儀器。采用梯度洗脫的方式可以達到對全部9種砷形態(tài)的基線分離，縮短N-AHAA和ROX的保留時間。而對于兩性離子AsB和As（III）（pKa=9.2）則可以通過調(diào)節(jié)pH值為8.75來實現(xiàn)分離。在優(yōu)化好的條件下，ROX、As（III）、DMA、MMA、As（V）、AsB、3-AHPAA、4-APAA和N-AHAA能在12 min內(nèi)完全分離。9種砷形態(tài)經(jīng)過HPLC的分離情況見圖1。

圖1 HPLC-AFS測定9種砷形態(tài)的強陰離子交換色譜圖Fig.1 Chromatograms showing strong anion exchange separation of nine species with HPLC-AFS detection

2.1.2 氫化物發(fā)生條件的優(yōu)化

砷形態(tài)混標經(jīng)過色譜柱分離后，與過硫酸鉀混合，在紫外燈的照射下，有機砷形態(tài)被消解為無機砷，最后在載流和還原劑的作用下，被還原為砷的氫化物，由氬氣載入原子化器加熱分解為原子態(tài)，空心陰極燈的發(fā)射光激發(fā)產(chǎn)生原子熒光。為了使有機態(tài)完全消解成無機態(tài)，確定過硫酸鉀濃度為3%。載流和還原劑的流速和濃度直接影響著氫化反應效率，通過采用單變量方法，每次變化其中一個變量，研究載流和還原劑的最優(yōu)化組合。

2.1.2.1 蠕動泵流速優(yōu)化

還原劑由蠕動泵來驅(qū)動，在泵管確定的條件下，蠕動泵的轉(zhuǎn)速決定了各種試劑的流速。試驗中首先研究了還原劑不同流速對于試驗結(jié)果的影響，確定HCl的蠕動泵轉(zhuǎn)速為110 r/min，研究不同還原劑流速對于試驗結(jié)果的影響。改變KBH4的蠕動泵轉(zhuǎn)速由80 r/min梯度增大，不同還原劑流速下熒光強度的檢測結(jié)果如圖2所示。

圖2 還原劑流速優(yōu)化試驗Fig.2 Optimization of reducing agent flow rate

由圖2可見，當KBH4流速較小時，由于還原劑不足，導致被測氫化元素氫化反應不完全，所以檢測信號強度不高，檢測靈敏度較低。不斷增大還原劑流速，檢測譜峰強度逐漸增大，譜峰面積增大，靈敏度增大。但是，隨著還原劑流速的增大，氫化反應愈加強烈，反應劇烈，氣液分離器中出現(xiàn)泡沫，檢測信號噪聲增大，信噪比下降。當蠕動泵轉(zhuǎn)速為110 r/min時，靈敏度較高，此時氫化反應強度適中，信號噪聲不高，所以選擇KBH4蠕動泵轉(zhuǎn)速為110 r/min。

2.1.2.2 還原劑濃度優(yōu)化

氫化反應中，還原劑應該適當過量，以保證氫化元素最大程度的發(fā)生氫化反應。選定HCl濃度5%，改變KBH4的濃度，通過一系列試驗來確定KBH4的最佳濃度。檢測樣品均采用濃度100 μg/L的9種砷形態(tài)混標。分別改變KBH4的濃度為15、20、25 g/L和30 g/L，利用原子熒光光譜儀檢測譜峰面積的結(jié)果如圖3所示。

圖3 硼氫化鉀濃度優(yōu)化試驗Fig.3 Optimization of potassium borohydride concentration

試驗中發(fā)現(xiàn)，剛開始時，隨著KBH4濃度的增加，各個成分的靈敏度均上升，至濃度為20 g/L時達到最大，隨著KBH4濃度的增加，9種成分的檢測靈敏度開始下降，其原因可能是隨著KBH4濃度的增加，氫化反應變得越來越劇烈，產(chǎn)生的氫氣越來越多，經(jīng)氣液分離器分離后送入AFS檢測器的氣流流速過大，對砷的氫化物具有一定的稀釋作用，從而降低了砷形態(tài)的原子熒光信號，導致了檢測靈敏度的下降。所以，還原劑KBH4的濃度選為20 g/L。

2.1.2.3 HCl濃度優(yōu)化

還原劑采用含5 g/L KOH的20 g/L KBH4溶液，改變HCl的濃度，通過一系列試驗來確定HCl的最佳濃度。檢測樣品均采用濃度100 μg/L的9種砷形態(tài)混標。分別改變HCl的濃度為4%、5%、7%和10%，利用原子熒光光譜儀檢測譜峰面積的結(jié)果如圖4所示。

圖4 鹽酸濃度優(yōu)化試驗Fig.4 Optimization of hydrochloric acid concentration

圖4中，在HCl濃度達到10%時，ROX及其他砷形態(tài)的靈敏度繼續(xù)減小，但是DMA反而有所上升，其原因可能是此時氫化反應比較劇烈，進入AFS檢測的氣體流速很大，造成原子熒光檢測器中原子化器的火焰跳動特別厲害，使得譜圖噪聲很大，在計算譜峰面積時，造成了誤差。所以，在還原劑采用含5 g/L KOH的20 g/L KBH4溶液的條件下，HCl的濃度選為7%。

2.1.3 原子熒光條件的優(yōu)化

在原子熒光檢測器中，光電倍增管電壓、空心陰極燈電流、載氣及屏蔽氣流量都會影響到最終的檢測靈敏度，通過一系列試驗研究了原子熒光檢測器主要參數(shù)的優(yōu)化條件，檢測樣品均為濃度100 μg/L的9種砷形態(tài)混標。評定各種參數(shù)條件下的信噪比，信噪比較高的為其最優(yōu)值。

2.1.3.1 光電倍增管高壓

光電倍增管主要對檢測到的熒光信號進行放大，加到它上面的負高壓的大小決定了其放大倍數(shù)。試驗中，分別選擇 300、310、320、330 V 和 340 V 5個梯度值，各參數(shù)下檢測信號的信噪比如圖5所示。

由圖5可見，當光電倍增管負高壓較小時，熒光信號較弱，譜峰強度較低，部分譜峰甚至淹沒在噪聲信號中，此時，信噪比較低；隨著負高壓的增大，熒光信號的放大倍數(shù)增大，而噪聲信號的強度也增大，信噪比提升較快。雖然各種砷形態(tài)的譜峰強度增大，但是當負高壓不斷增大時，信號本底值、各種噪聲信號的強度也一直增大，至330 V以后，雖然繼續(xù)增大負高壓，熒光信號強度繼續(xù)增大，但是信噪比卻開始下降，因為此時噪聲信號增大的程度變得越來越大，所以，選擇330 V為光電倍增管負高壓的最優(yōu)值，因為此時信噪比最大，信號強度較高，而本底值也相對較低。

圖5 不同負高壓下的信噪比Fig.5 Signal to noise ratio under different negative high voltage

2.1.3.2 空心陰極燈電流優(yōu)化

空心陰極燈用來激發(fā)熒光信號，被測元素原子吸收空心陰極燈輻射的能量，躍遷到較高能級，當回到基態(tài)時，便發(fā)出熒光信號，所以，空心陰極燈輻射強度的大小會影響到吸收輻射能量的原子數(shù)量，繼而影響到輻射的熒光信號的強度?？招年帢O燈采用集束脈沖式供電，脈沖電流的大小決定了輻射能量的高低。試驗中，不斷增強空心陰極燈的燈電流，從80 mA梯度增大，如圖6所示。

圖6 不同燈電流下的信噪比Fig.6 Signal to noise ratio under different lamp current

從圖6中可以看出，當空心陰極燈電流較小時，激發(fā)的熒光信號較弱，譜峰強度較低，部分譜峰甚至湮沒在噪聲信號中，此時，信噪比較低；隨著空心陰極燈電流的逐漸增大，檢測信號的強度也逐漸增大，當增大到100 mA時，信噪比達到最大，而后隨著燈電流的增大，信噪比反而開始下降，其原因可能是燈電流在100 mA后發(fā)生了自吸，從而使得熒光信號反而減弱，且燈電流越大，自吸現(xiàn)象越嚴重，而譜峰信號越弱；另外，過大的燈電流可能會影響空心陰極燈的使用壽命，甚至造成損壞。所以，本試驗采用100 mA空心陰極燈電流。

2.1.3.3 載氣流速優(yōu)化

載氣的作用是一方面吹掃反應過程中產(chǎn)生的被測元素氫化氣，將其送到原子化器中被原子化后實現(xiàn)檢測；另一方面與反應生成的氫氣一起在原子化器中形成氬氫火焰，使被測元素氫化物形成原子蒸氣。所以載氣會影響到原子化效率以及氬氫火焰的穩(wěn)定性，繼而影響到信噪比的大小。試驗中，使流速從300 mL/min不斷增大，比較不同載氣流速下熒光強度的大小，所得結(jié)果如圖7所示。

圖7 載氣流速優(yōu)化試驗Fig.7 Optimization of flow velocity of carrier gas

從圖7中看出，一開始時熒光強度較小，因為在流速較小時，氬氣吹掃能力不足，反應生成的氫氣流量不穩(wěn)定，使得氬氫火焰不穩(wěn)定，造成火焰抖動，從而使得檢測信號抖動，噪聲增大，所以信噪比較低。不斷增大載氣流量，在流量達到500 mL/min后，隨著載氣流量的增大，吹掃速度增大，但是譜峰強度卻降低得較多，使得被測元素氫化物未能完全原子化即被排出，所以熒光強度開始減小。當載氣流速為400 mL/min時，熒光強度最大，此時吹掃速度適中，而氬氫火焰也比較穩(wěn)定，噪聲較小，所以最終選定400 mL/min為載氣流速的最優(yōu)值。

2.1.3.4 屏蔽氣流速優(yōu)化

屏蔽氣主要是在原子化器中用來保護原子化蒸氣不被氧化，易吸收空心陰極燈的輻射能量，使得熒光信號增強，所以屏蔽器的流量選擇主要從經(jīng)濟方面考慮，選擇最小的屏蔽氣流量，達到最佳的屏蔽作用。如圖8所示，使屏蔽氣流速從800 mL/min不斷增大，比較不同屏蔽氣流速下熒光強度大小。

由圖8中可以看出，在屏蔽氣流速較小時，所檢測得到的熒光強度較小，而噪聲信號較強，說明空氣中的氧氣與部分原子化后的氣體發(fā)生了氧化反應，受激熒光輻射不足。不斷增大屏蔽氣流速，譜峰面積逐漸增大，噪聲信號強度減小，當流速達到900 mL/min～1 000 mL/min時，熒光強度達到最大，從經(jīng)濟方面考慮，選擇900 mL/min為屏蔽氣流量。

圖8 屏蔽氣流速優(yōu)化試驗Fig.8 Optimization of flow velocity of shield gas

2.2 線性方程及檢出限

ROX及其代謝物在不同的線性范圍內(nèi)的線性方程、相關(guān)系數(shù)R2見表1。由表1可得，各砷形態(tài)的濃度與峰面積呈線性相關(guān)，相關(guān)性R2＞0.997，符合定量要求。

表1 ROX及其代謝物的一元線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 1 Linearity regression and coefficient of correlation for ROX and its metabolites

2.3 精密度和回收率

采用上述方法檢測這9種不同的砷形態(tài)，重復6次，計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）和添加回收率，如表2所示。

表2 ROX及其代謝物的回收率和相對標準偏差Table 2 Recoveries and inter-day relative standard deviation of ROX and its metabolites

由表2可知，試樣中9種砷形態(tài)的加標回收率在80.1%～96.0%范圍內(nèi)，RSD都控制在9%以內(nèi)，說明該方法能較好的保持形態(tài)穩(wěn)定性，可靠性和可重復性良好。

2.4 樣品分析

實驗室對豬和雞連續(xù)飼喂ROX，對飼喂第28天的雞肝、雞腎、豬肝、豬腎樣品的砷形態(tài)進行MEAHPLC-HG-AFS分析，結(jié)果見表3。

表3 雞肝、雞腎、豬肝、豬腎中ROX及其代謝物的含量Table 3 Content of ROX and its metabolites in chicken liver，chicken kidney，pig liver and pig kidney μg/kg

本方法分別檢測到了 ROX、As（III）、DMA、MMA、As（V）、AsB、3-AHPAA 和 N-AHAA。其中 3-AHPAA是ROX的還原產(chǎn)物，而N-AHAA則是進一步乙?；漠a(chǎn)物。

3 結(jié)論

本文介紹了采用微波輔助萃取-高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法同時測定洛克沙砷及其8種代謝物殘留量，探討了試驗條件的優(yōu)化和試驗方法的驗證。最終優(yōu)化結(jié)果為流動相：（A）5%甲醇；（B）5%甲醇-60 mmol/L碳酸氫銨溶液，pH 8.75；負高壓：330 V；燈電流：100 mA；載氣流量：400 mL/min；屏蔽氣流量：900 mL/min；載流：7%HCl溶液；載流流速：110 r/min；還原劑：5 g/L KOH-20 g/L KBH4；還原劑流速：110 r/min。提取試劑：甲醇-水提取液（1 ∶1，體積比）；提取溫度：80℃。驗證結(jié)果表明建立的方法具有良好的回收率，并且方法穩(wěn)定性高、重復性好，將應用于后續(xù)的工作，以實現(xiàn)對動物體內(nèi)ROX的分布以及代謝途徑的分析。