加壓毛細(xì)管電色譜法分析調(diào)味果蔬汁飲品中5種有機(jī)酸

桑大席，張孔海

（信陽農(nóng)林學(xué)院食品學(xué)院，河南信陽464000）

有機(jī)酸作為食品添加劑添加到食品中，具有增強(qiáng)酸味、調(diào)節(jié)pH值的作用，常用的有蘋果酸、乙酸、檸檬酸等[1-2]。調(diào)味果蔬汁飲品是指在果蔬汁的基礎(chǔ)上添加一些其他食品輔料，調(diào)配口味，其富含對(duì)人體有益的碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)的特點(diǎn)，深受消費(fèi)者的喜愛。調(diào)味果蔬汁飲品中一般都會(huì)添加蘋果酸、檸檬酸等有機(jī)酸作為酸度調(diào)節(jié)劑，具有調(diào)節(jié)飲品的pH值，改善飲品的風(fēng)味，延長(zhǎng)產(chǎn)品保質(zhì)期的作用[3-4]。調(diào)味果蔬汁飲品中有機(jī)酸缺乏或過量均會(huì)導(dǎo)致口感不協(xié)調(diào)，因此需要對(duì)這類產(chǎn)品中有機(jī)酸的使用情況進(jìn)行檢測(cè)和監(jiān)控[5-6]。

在調(diào)味果蔬汁飲品的研究中，檢測(cè)其營(yíng)養(yǎng)成分的研究較多，但與之相關(guān)的有機(jī)酸的檢測(cè)研究較少。參考相關(guān)有機(jī)酸的檢測(cè)方法，主要有離子色譜法[7-10]、氣相色譜法[11-12]和高效液相色譜法[13-15]，3種方法各有優(yōu)勢(shì)，但分析時(shí)間都較長(zhǎng)。加壓毛細(xì)管電色譜技術(shù)是一種結(jié)合了毛細(xì)管電泳的高柱效以及高效液相色譜的高選擇性的新型電動(dòng)微分離技術(shù)，具備二者的雙重分離機(jī)理[14-16]。與傳統(tǒng)高效液相色譜相比，加壓毛細(xì)管電色譜除壓力流驅(qū)動(dòng)外，還有電滲流驅(qū)動(dòng)，柱效更高，分離速度更快，更適合復(fù)雜樣品的多組分檢測(cè)。本研究嘗試將加壓毛細(xì)管電色譜（pressurized capillary electrochromatography，pCEC）雙重分離機(jī)理與二極管陣列檢測(cè)器（photodiode detec array，PDA）的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合，開發(fā)調(diào)味果蔬汁飲品中草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、乙酸共5種有機(jī)酸的分析檢測(cè)新方法，并對(duì)前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，所開發(fā)的pCEC-PDA檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、分析速度快，具有實(shí)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

2100型加壓毛細(xì)管電色譜系統(tǒng)、U3000型二極管陣列檢測(cè)器：美國(guó)賽默飛公司。

草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、乙酸標(biāo)準(zhǔn)品：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

1.2 色譜條件

色譜柱：Waters sunfire C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

柱溫：30℃；流動(dòng)相為乙腈∶水=80∶20（體積比）。

1.3 試驗(yàn)方法

參考相關(guān)文獻(xiàn)[17-19]中有機(jī)酸的分離條件，采用親水作用毛細(xì)管電色譜柱進(jìn)行5種有機(jī)酸的分離。并通過對(duì)流動(dòng)相添加劑體系、電壓強(qiáng)度分離條件的優(yōu)化，以及檢測(cè)波長(zhǎng)選擇、前處理?xiàng)l件的優(yōu)化，最終確定分析調(diào)味果蔬汁飲品中5種有機(jī)酸的整體方法。

1.3.1 流動(dòng)相添加劑對(duì)有機(jī)酸色譜行為的影響

本試驗(yàn)以流動(dòng)相（乙腈∶水=80∶20，體積比）為基礎(chǔ)，在流動(dòng)相中分別加入磷酸二氫鉀（0.05 mol/L，pH 2.7）、偏磷酸（0.01 mol/L，pH 2.7）和磷酸二氫銨（0.05 mol/L，pH 2.7），并調(diào)節(jié)流動(dòng)相體系不同的pH值，考察5種有機(jī)酸在不同流動(dòng)相添加體系的分離情況和信噪比。

1.3.2 電壓強(qiáng)度對(duì)有機(jī)酸色譜行為的影響

電壓是加壓毛細(xì)管電色譜試驗(yàn)條件中一個(gè)重要的試驗(yàn)參數(shù)，施加不同的電壓強(qiáng)度對(duì)樣品的分離能力和分離速度會(huì)產(chǎn)生不同影響，試驗(yàn)分別施加0、2、4、5、8 kV正向電壓，考察5種有機(jī)酸在不同電壓強(qiáng)度下的分離情況。

1.3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

影響二極管陣列檢測(cè)器靈敏度的關(guān)鍵參數(shù)一般是特征波長(zhǎng)的選擇，較佳的特征波長(zhǎng)選擇會(huì)降低雜質(zhì)峰對(duì)目標(biāo)的影響，減少干擾，一般建立適當(dāng)?shù)亩O管陣列檢測(cè)方法時(shí)，需對(duì)此參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別吸取一定質(zhì)量的5種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為 1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 μg/mL 的混合標(biāo)液，進(jìn)儀器分析并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 樣品前處理方法的優(yōu)化

常用于液態(tài)樣品提取溶劑的有甲醇、乙醚、磷酸、偏磷酸、乙醇等，鑒于甲醇、乙醚具有一定的毒性，而用磷酸、偏磷酸提取調(diào)味果蔬汁飲品時(shí)會(huì)因提取液中酸根陰離子的存在而影響有機(jī)酸的分離測(cè)定，因而綜合考慮選擇乙醇作為提取劑，并對(duì)提取劑的濃度進(jìn)行優(yōu)化選擇。

不同提取方式對(duì)目標(biāo)物的提取有很大影響，以10%乙醇作為提取劑，比較5種不同方式的提取效果。方式Ⅰ：樣品提取劑加入調(diào)味果蔬汁飲品后直接離心（5 000 r/min，10 min）；方式Ⅱ：提取劑加入調(diào)味果蔬汁飲品后靜置 30 min，離心（5 000 r/min，10 min）；方式Ⅲ：提取劑加入調(diào)味果蔬汁飲品后均質(zhì)，離心（5 000 r/min，10 min）；方式Ⅳ：提取劑加入調(diào)味果蔬汁飲品后振蕩30 min，離心（5 000 r/min，10 min）；方式Ⅴ：提取劑加入調(diào)味果蔬汁飲品后超聲30 min，離心（5 000 r/min，10 min）。

1.3.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)及樣品的檢測(cè)

以已知含量有機(jī)酸的調(diào)味果蔬汁飲品為基質(zhì)，加入混合標(biāo)準(zhǔn)液，選擇優(yōu)化后的前處理?xiàng)l件操作，上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算回收率，并以上述優(yōu)化后的條件檢測(cè)抽取的樣品。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)以平均值表示，采用Excel 2013軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相添加劑對(duì)有機(jī)酸色譜行為的影響

有機(jī)酸在色譜系統(tǒng)中的分離是依據(jù)在色譜柱和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)不同而進(jìn)行的，由于其組分極性較大，流動(dòng)相中的水比例不能太高，否則有機(jī)酸會(huì)發(fā)生解離。為了能使5種有機(jī)酸在色譜系統(tǒng)中以分子形式存在，一般使用酸性流動(dòng)相來進(jìn)行組分的分離。本試驗(yàn)比較流動(dòng)相（乙腈∶水=80∶20，體積比）中添加磷酸二氫鉀（0.05 mol/L，pH 2.7）、偏磷酸（0.01 mol/L，pH 2.7）和磷酸二氫銨（NH4）2HPO4（0.05 mol/L，pH 2.7）3種添加劑[20-21]，研究對(duì)5種有機(jī)酸色譜行為的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 流動(dòng)相組成對(duì)有機(jī)酸色譜行為的影響Fig.1 Effect of mobile phase composition on chromatographic behavior of organic acids

由圖1可知，3種添加劑體系對(duì)5種有機(jī)酸的色譜行為影響不同。隨著流動(dòng)相組成的不同，5種有機(jī)酸的保留時(shí)間也不相同，且峰形、分離度和響應(yīng)信號(hào)均發(fā)生了較大變化。對(duì)比3個(gè)圖可知，當(dāng)流動(dòng)相添加劑為磷酸二氫鉀（0.05 mol/L，pH 2.7）時(shí)，5種有機(jī)酸能達(dá)到很好的分離效果；而流動(dòng)相添加劑為偏磷酸（0.01 mol/L，pH 2.7）或磷酸二氫銨（0.05 mol/L，pH 2.7）時(shí)，5種有機(jī)酸并不能達(dá)到相應(yīng)的分離效果，且檢測(cè)基線不穩(wěn)定、噪音較大。因此，本研究選擇流動(dòng)相添加劑為磷酸二氫鉀。

2.1.2 流動(dòng)相添加劑pH值對(duì)有機(jī)酸色譜行為的影響

在流動(dòng)相中加入0.05mol/L磷酸二氫鉀，固定流速為0.8mL/min，柱溫為30℃，4kV正向電壓，用100 mmol/L磷酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相添加劑的pH值，比較2.1、2.3、2.5、2.7、2.9五個(gè)不同pH值的流動(dòng)相添加劑對(duì)5種有機(jī)酸組分保留時(shí)間和分離度的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，從保留時(shí)間上看，隨著流動(dòng)相pH值的增大，草酸、檸檬酸、酒石酸的保留時(shí)間延長(zhǎng)，而蘋果酸、乙酸的保留時(shí)間基本不受流動(dòng)相pH值的影響。從分離度上看，隨著流動(dòng)相pH值增加，草酸、檸檬酸和酒石酸分離度越好。綜合考慮保留時(shí)間和分離度，選擇pH 2.5的0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液作為流動(dòng)相添加劑較佳。

圖2 流動(dòng)相添加劑pH值對(duì)有機(jī)酸保留時(shí)間的影響Fig.2 Effect of pH of mobile phase on the retention time of organic acids

2.2 電壓強(qiáng)度的選擇

在流動(dòng)相中加入磷酸二氫鉀溶液（0.05 mol/L，pH 2.5），分別施加 0、2、4、5、8 kV 正向電壓，結(jié)果如圖 3所示。

圖3 電壓強(qiáng)度對(duì)有機(jī)酸分離速度的影響Fig.3 Effect of voltage intensity on retention time for organic acids

由圖3可知，隨著電壓升高，在電滲流的推動(dòng)下5種有機(jī)酸的分離速度明顯加快，同時(shí)色譜峰形變窄；當(dāng)施加電壓為+5 kV時(shí)，樣品分離時(shí)間加快到15 min左右，蘋果酸、乙酸的保留時(shí)間明顯提前，并且5種有機(jī)酸樣品完全分離。當(dāng)施加電壓達(dá)到+8 kV后，分離速度無明顯加快，并且儀器電流急劇增大，故本試驗(yàn)最終選擇+5 kV為施加電壓。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本試驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，在檢測(cè)波長(zhǎng)190 nm～600 nm范圍內(nèi)對(duì)5種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描[22-23]，根據(jù)各個(gè)組分的全波長(zhǎng)掃描選擇最大的吸收波長(zhǎng)，結(jié)果見圖4。

圖4 5種有機(jī)酸的全波長(zhǎng)掃描圖Fig.4 Full wavelength scanning chart of five organic acids

結(jié)果顯示有4種有機(jī)酸在210 nm波長(zhǎng)附近有較大吸收，只有草酸在257 nm和427 nm波長(zhǎng)處有較大吸收，綜合考慮，選用210 nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

5 種目標(biāo)組分在 1.0 μg/mL～50.0 μg/mL 內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，其中檸檬酸、酒石酸、蘋果酸的檢出限為0.20 mg/kg，定量限為0.60 mg/kg；草酸和乙酸的檢出限為0.30 mg/kg，定量限為1.0 mg/kg，結(jié)果見表1。

表1 5種組分的保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 1 Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of five targets

2.5 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.5.1 不同濃度乙醇溶液提取效果

圖5為乙醇濃度分別為5%、10%、20%、30%、40%、50%做提取劑時(shí)各有機(jī)酸組分含量的測(cè)定結(jié)果。

圖5 有機(jī)酸組分含量隨提取劑配比變化情況Fig.5 The organic acids content increased with extracting ratio change agent

由圖5可知，以檸檬酸為例，隨著乙醇濃度的增加，提取液中檸檬酸檢測(cè)含量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，在以10%乙醇作為提取溶液時(shí)，檸檬酸的含量能達(dá)到5.8 mg/100 g，而以20%乙醇溶液和30%乙醇溶液提取時(shí)檸檬酸含量分別降低了10.3%和15.5%，以40%乙醇溶液和50%乙醇溶液提取時(shí)檸檬酸含量分別降低了34.4%和60.3%。樣品中其他4種組分含量變化也類似，也表現(xiàn)為用10%乙醇溶液提取時(shí)含量最高，其他濃度的乙醇溶液為提取劑時(shí)，組分含量分別有不同程度的降幅。

2.5.2 提取方式的選擇

5種提取方式的試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同提取方式對(duì)有機(jī)酸測(cè)定結(jié)果的影響Fig.6 Effect of different extraction methods on determination results of organic acid

由圖6可知，以檸檬酸為例，提取方式Ⅴ顯著高于其他4種提取方式；乙酸中方式Ⅴ和方式Ⅳ差異明顯，但是明顯高于方式Ⅲ、方式Ⅱ和方式Ⅰ；其他3種酸中也是提取方式Ⅴ的含量最高。由此可見，提取方式Ⅰ、提取方式Ⅱ和提取方式Ⅲ均有對(duì)目標(biāo)物提取不完全的缺陷，而提取方式Ⅴ的效果優(yōu)于提取方式Ⅳ的效果。因此，本方法選擇提取方式Ⅴ即樣品加入提取劑后超聲 30 min，并離心（5 000 r/min，10 min）的提取方式為適宜。

2.6 加標(biāo)回收率與精密度

以已知有機(jī)酸含量的調(diào)味果蔬汁飲品為基質(zhì)，分別添加1.0、10.0、50.0 mg/kg 3個(gè)梯度濃度的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定5次，測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 方法的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviations，RSD）（n=5）Table 2 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method（n=5）

由表2可見，5種組分3個(gè)水平的加標(biāo)回收率為90.5%～95.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.3%～4.6%，表明本試驗(yàn)所建立的方法能夠滿足檢測(cè)實(shí)際樣品需要。

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

在市場(chǎng)上隨機(jī)抽取5種調(diào)味果蔬汁飲品檢測(cè)其中的有機(jī)酸，檢測(cè)結(jié)果見表3。

表3 樣品中5種有機(jī)酸的測(cè)定（n=5）Table 3 Determination of five organic acids in samples（n=5）mg/100 mL

由表3可以看出不同種類的調(diào)味果蔬汁飲品中含有的有機(jī)酸種類和含量差異較大，5款飲品中都含有蘋果酸，而檸檬酸、酒石酸和乙酸這3種有機(jī)酸只有個(gè)別飲品中有，而草酸在這5種飲品中沒有檢出，整體有機(jī)酸檢測(cè)到的種類與產(chǎn)品外包裝標(biāo)簽中標(biāo)出的一致。針對(duì)分析測(cè)定的結(jié)果，可以根據(jù)自身的需要，選用不同類型的調(diào)味果蔬汁飲品，來補(bǔ)充全面的或者單一的有機(jī)酸。

3 結(jié)論

本文利用加壓毛細(xì)管電色譜-二極管陣列聯(lián)用法，通過對(duì)流動(dòng)相體系的組成、流動(dòng)相添加劑的pH值、電壓強(qiáng)度和檢測(cè)波長(zhǎng)的優(yōu)化，以及樣品提取液、提取方法的比較，建立了同時(shí)分離檢測(cè)調(diào)味果蔬汁飲品中草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸和乙酸5種有機(jī)酸的親水作用電色譜法。結(jié)果表明，采用Waters sunfire C18色譜柱，選擇pH2.5的0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液作為流動(dòng)相（乙腈∶水=80∶20，體積比）的添加劑，電壓強(qiáng)度為+5 kV，流速為0.8 mL/min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm的條件下，5種目標(biāo)組分能在1.0 μg/mL～50.0 μg/mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，檢出限范圍為0.20 mg/kg～0.30 mg/kg，定量限范圍為0.60 mg/kg～1.0 mg/kg。樣品加入10%乙醇提取并超聲30 min后，加標(biāo)回收率能達(dá)到90.5%～95.7%，RSD為2.3%～4.6%，所建立的方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度，能準(zhǔn)確快速有效地檢測(cè)調(diào)味果蔬汁飲品中的5種有機(jī)酸的含量，可為調(diào)味果蔬汁飲品中多種有機(jī)酸的分析和監(jiān)控提供技術(shù)支持。