冷藏真空包裝金鯧魚片復合生物保鮮劑配方優(yōu)化

于淑池，林美君，王睿迪，裴志勝，楊波

（1.海南熱帶海洋學院海南省海洋食品工程技術研究中心，海南三亞572022；2.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003）

金鯧魚（golden pompano）學名卵形鯧鲹，地方名稱黃臘鯧，金鯧，屬硬骨魚綱、鱸形目、鯧鲹屬[1]，其魚肉細嫩，味道鮮美，營養(yǎng)豐富[2]，是我國海南、廣東沿海重要的海產經(jīng)濟魚類之一[3]。目前金鯧魚保鮮多采用凍藏[4]，隨著消費觀念的轉變，人們越來越關注水產品的新鮮度[5]，通過低溫（0℃～4℃）貯藏的魚肉與新鮮魚肉的品質更為接近，更受到消費者的青睞[6]。而低溫冷藏下卵形鯧鲹的貨架期太短[7]，極大地限制了卵形鯧鲹的流通和加工，而現(xiàn)有的冷藏保鮮方法如物理法因成本較高不能被廣泛應用；化學保鮮法則會引起微生物的耐藥性及化學物質殘留等副作用；生物保鮮技術因其具有天然、安全、方便等優(yōu)點，已成為水產品貯藏保鮮的研究熱點[8]。生物保鮮劑可以分為動物源、植物源和微生物源保鮮劑[9]。殼聚糖（chitosan）作為動物源保鮮劑目前應用比較廣泛，是甲殼素脫N-乙酰基的產物，具有很強的抑菌效果[10-11]；茶多酚（tea polyphenols）是茶葉中多酚類物質的總稱，也稱抗氧靈，安全無毒，且具有明顯的抗菌、抗氧化作用，也可以抑制微生物的生長繁殖[12-14]，是一種具有推廣價值的天然保鮮劑[15]；ε-聚賴氨酸（ε-L-polylysine，ε-PL）是微生物分泌的天然廣譜性抑菌物質，具有抑菌、安全、無毒、穩(wěn)定性強諸多優(yōu)點，已被廣泛用作食品防腐劑[16]，ε-聚賴氨酸鹽酸鹽是一種營養(yǎng)型生物保鮮劑，具有良好的保鮮性能。

復合生物保鮮劑是將具有不同功能或來源的保鮮劑協(xié)同使用，形成一種高效的復合保鮮劑，可以大大提高水產品的保鮮效果[17-19]。

目前金鯧魚的生物保鮮研究報道較少，僅有楊坤等[20]研究了表沒食子兒茶素沒食子酸酯對冷藏金鯧魚魚片保鮮品質的影響；林曉霞等[21]研究了番石榴多酚可以顯著延長金鯧魚糜的貨架期，具有良好的保鮮效果；張涵等[22]研究了聚賴氨酸（ε-PL）與海藻酸鈉復合成膜，協(xié)同氣調包裝對金鯧魚冷藏保鮮作用；將不同生物來源的保鮮劑進行復配，探究復合生物保鮮劑對真空包裝冷藏金鯧魚片的保鮮效果的研究尚未見報道。

本研究以冷藏金鯧魚片為研究材料，以感官評價，菌落總數(shù)，揮發(fā)性鹽基氮為指標，優(yōu)化茶多酚、殼聚糖、ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對冷藏金鯧魚片保鮮的最佳配方并進行應用驗證。旨在為金鯧魚的加工保鮮提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

金鯧魚：（600±15）g，海南三亞市勝利路旺豪超市。

ε-聚賴氨酸鹽酸鹽（食品級）：浙江新銀象生物工程有限公司；茶多酚（食品級）：河南千志商貿有限公司；殼聚糖（食品級）：河南通宇食品化工有限公司；硼酸、氯化鈉、鹽酸、95%乙醇、營養(yǎng)瓊脂：均為分析純，西隴科學股份有限公司；氧化鎂（分析純）：上海強順化學試劑有限公司；甲基紅、次甲基蘭：均為分析純，天津市天新精細化工開發(fā)中心。

N5000型質構儀：上海佑科儀器儀表有限公司；MesoMR23-060H-1型核磁共振成像分析儀：蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；ME204E/02型電子天平、SG8型精密pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DZ-500/1s型真空包裝機：浙江溫州市達豐機械有限公司；DS-150型恒溫恒濕試驗箱：蘇州市易維試驗儀器有限公司；J-2型菌落計數(shù)器：江蘇天翎儀器有限公司；FOSS Kjeltec8400型全自動凱氏定氮儀：丹麥FOSS中國上海有限公司。

1.2 方法

1.2.1 金鯧魚保鮮處理的工藝流程

鮮活金鯧魚→敲頭致死→清洗表面黏液→預處理（去頭、去內臟）→剖半片魚[（60±0.1）g]→保鮮劑冰浴浸泡1 h[魚片與處理液料液比為1∶2（g/mL）]→取出瀝干→真空包裝→4℃冰箱冷藏→檢測相關指標

1.2.2 正交試驗

根據(jù)GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[23]，水產品中允許添加的茶多酚、殼聚糖和ε-聚賴氨酸鹽酸鹽的最高用量分別為0.3、6.0、0.3 g/kg，由預試驗可知，單一生物保鮮劑對金鯧魚片的保鮮效果顯示：茶多酚用量為0.2 g/kg，殼聚糖用量為4.0 g/kg，ε-聚賴氨酸鹽酸鹽用量為0.25 g/kg保鮮效果最好，對每個因素選取3個水平，選用L9（33）正交試驗，以感官評分、菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值作為評價指標，真空包裝4℃冰箱冷藏10 d，最終分析確定最佳復合保鮮劑配方。正交試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal experiment factor level

1.2.3 應用試驗

對最優(yōu)復合保鮮劑進行應用驗證，以菌落總數(shù)、感官評分、TVB-N值作為主要指標，pH值、質構分析、低磁場核磁分析技術為輔助指標，以空白組（未經(jīng)保鮮劑處理）為對照，測定真空包裝4℃冷藏14 d各指標的變化情況，探究最優(yōu)復合保鮮劑對金鯧魚片的保鮮效果。

1.2.4 各指標測定方法

1.2.4.1 感官評定

感官評定采用GB/T 18108-2008《鮮海水魚》的方法[24]，評定人員由固定10人組成，以色澤、氣味、組織形態(tài)、組織彈性為評定項目，每個評定項目滿分分別為25分，總分100分，80分～100分品質最好，40分作為可接受界限，40分以下則不能食用，20分以下品質最差。

1.2.4.2 菌落總數(shù)測定

菌落總數(shù)測定參照GB/T4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》的方法[25]。

1.2.4.3 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）測定

參照GB/T 5009.228-2016《食品安全國家標準食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中半微量擴散法[26]。

1.2.4.4 pH值的測定

按照GB/T5009.237-2016《食品安全國家標準食品中pH值的測定》方法[27]。

1.2.4.5 質構分析

測量參數(shù)包括硬度、咀嚼力和彈性。取金鯧魚片背部靠近脊骨處的魚肉，采用質構剖面分析（texture profile analysis，TPA）測量模式，預測試速度 3 mm/s，測試速度1 mm/s，返回速度5 mm/s，觸發(fā)點負載5 g，目標2.0 mm，力量感應元大小為1 000 N，探頭升高距樣品表面20 mm，形變量50%，起始力0.9 N[28]。

1.2.4.6 低磁場核磁分析

應用紐邁臺式脈沖核磁共振分析儀（nuclear magnetic resonance，NMR）進行NMR自旋，并測量自旋弛豫時間（T2）。取質量約10g的金鯧魚肉放入直徑60mm的核磁管中。測試參數(shù)：分析磁體線圈60 mm，測量溫度 32 ℃，起始脈沖寬度 1.0 μs，結束脈沖寬度 36.0 μs，累加步長 1.0 μs，射頻信號頻率主值22 MHz，射頻信號頻率偏移量840 152.79 Hz，重復采樣間隔時間2 500 ms，90°脈寬 13 μs，80°脈寬 26 μs，采樣點數(shù)1 024，采樣頻率 200 kHz，回波時間 300 μs，回波個數(shù)5 000，重復采樣4次，采樣起始點控制參數(shù)80 μs，迭代次數(shù)100 000。

1.3 數(shù)據(jù)處理

Excel作圖，Origin 2017（Origin Lab Corp.LTD）繪制弛豫信號曲線圖，顯著性差異采用Duncan多重比較檢驗分析（P＜0.05），試驗結果以平均值±標準偏差來表示。

2 結果與分析

2.1 正交試驗的結果

按照表1的因素水平設置進行正交試驗，結果見表2。

表2 正交試驗結果分析Table 2 Analysis table of orthogonal experiment results

由表2可知，從感官評分、菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮3個指標的極差分析結果來看，3種保鮮劑的影響順序均為A（茶多酚用量）＞C（ε-聚賴氨酸鹽酸鹽用量）＞B（殼聚糖用量）；從感官評分指標分析，因素的最優(yōu)水平組合為A3B2C1或A3B2C2，保鮮效果等同最佳；菌落總數(shù)指標最優(yōu)水平組合為A2B2C3；揮發(fā)性鹽基氮值的最優(yōu)水平組合為A2B1C3；而感官評分的最優(yōu)組合A3B2C1是正交試驗的第8組（實際最優(yōu)組），因此將其他3個最優(yōu)水平組合進行為期10 d的驗證試驗，每組試驗重復3次，取平均值，結果見表3。

表3 正交試驗最優(yōu)水平組合驗證試驗結果Table 3 Verification test results of optimal horizontal combination of orthogonal experiments

從表3可以看出，菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮的最優(yōu)水平組合與感官評分組合相比，驗證測得的3個指標值感官評分總體偏低；菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮值較高，揭示這兩個組合的保鮮效果一般；感官評分組合A3B2C2驗證試驗結果顯示，感官評分與表2的第8組A3B2C1一致，菌落總數(shù)略有升高，而揮發(fā)性鹽基氮指標較低，顯示A3B2C2組合保鮮效果優(yōu)于正交試驗第8組A3B2C1，因此確定A3B2C2（即茶多酚用量0.25 g/kg、殼聚糖用量4 g/kg、ε-聚賴氨酸鹽酸鹽用量0.25 g/kg復配）為最優(yōu)組合配方。

2.2 復合保鮮劑最優(yōu)配方的應用試驗結果

2.2.1 復合保鮮劑處理對真空包裝冷藏金鯧魚片感官品質的影響

復合保鮮劑處理后，冷藏期間金鯧魚片感官品質的變化結果見圖1。

圖1 真空包裝金鯧魚片冷藏期間感官品質的變化Fig.1 Changes in sensory quality of vacuum packed golden pompano fillets during cold storage

從圖1中可以看出，兩個處理組隨著時間的推移，感官評分逐漸下降，空白對照組在第10天完全劣變，感官已無法接受（感官評分34分＜40分臨界點），有刺激性氨味產生，體表無光澤，有油脂滲出，魚脂大塊脫落，組織纖維松散癥狀；復合保鮮劑組仍有較清淡的魚腥味，魚脂緊貼體表，組織纖維致密，第14天時感官評分為40分，達到可接受界限。

2.2.2 復合保鮮劑處理對真空包裝冷藏金鯧魚片菌落總數(shù)的影響

冷藏期間金鯧魚片菌落總數(shù)的變化結果見圖2。

圖2 真空包裝金鯧魚片冷藏期間菌落總數(shù)的變化Fig.2 Changes in aerobic plate count of vacuum packed golden pompano fillets during iced storage

水產品在貯藏過程中容易受到微生物污染而引起品質下降，菌落總數(shù)是很多國家檢測水產品品質的一個常規(guī)指標[29]。從圖2中可以看出，兩個處理組隨著時間的推移，菌落總數(shù)逐漸上升，復合保鮮劑組總體低于空白組，顯示具有較強的殺菌和抑菌作用。GB 18406.4-2001《農產品安全質量無公害水產品安全要求》規(guī)定細菌總數(shù)應不大于6lg（cfu/g），以此判斷水產品貨架期終點，空白對照組在第8天時[6.89 lg（cfu/g）]已經(jīng)超出貨架期，而復合保鮮劑組在第12天時 [6.73 lg（cfu/g）]才超出貨架期。

2.2.3 復合保鮮劑處理對真空包裝冷藏金鯧魚片揮發(fā)性鹽基氮指標的影響

冷藏期間金鯧魚片揮發(fā)性鹽基氮指標的變化結果見圖3。

圖3 真空包裝金鯧魚片冷藏期間揮發(fā)性鹽基氮的變化Fig.3 Changes in TVB-N of vacuum packed golden pompano fillets during iced storage

按GB 2733-2005《鮮、凍動物性水產品衛(wèi)生標準》[30]規(guī)定，揮發(fā)性鹽基氮值（TVB-N）應該不超過30 mg/100 g，海水魚一般TVB-N≤15 mg/100 g為一級鮮度，TVB-N≤30 mg/100 g為二級品。從圖3中可以看出，兩個處理組隨著時間的推移，TVB-N逐漸上升，復合保鮮劑組總體低于空白對照組，與菌落總數(shù)和感官品質的變化規(guī)律基本相符，空白對照組在第10天時TVB-N在28.76 mg/100 g，接近二級品，隨后逐漸腐?。粡秃媳ｕr劑組14 d時的TVB-N值為29.56 mg/100 g，接近二級鮮度終點，遠低于空白對照組?？瞻讓φ战M在 5 d～6 d時超出一級鮮度（＞15 mg/100 g），復合保鮮劑組則在9 d～10 d時超出一級鮮度；空白對照組貨架期（超過30 mg/100 g）約為10d～11d，復合保鮮劑組貨架期則為14d～15d，一級鮮度和貨架期均比空白對照組延長4 d左右。

2.2.4 復合保鮮劑處理對真空包裝冷藏金鯧魚片pH值的影響

冷藏期間金鯧魚片pH值的變化結果見圖4。

圖4 真空包裝金鯧魚片冷藏期間pH值的變化Fig.4 Changes in pH value of vacuum packed golden pompano fillets during cold storage

魚體死后，pH值變化是先下降后升高，下降是因為體內糖原降解，乳酸積聚，升高是因為體內蛋白質及其他含氮有機物分解產生氮和氨等堿性物質。從圖4可以看出，復合保鮮劑能有效抑制糖原的分解和乳酸的積聚，因此在第2天和第4天時pH值高于對照組，隨著貯藏時間的增加，蛋白質等物質開始分解，復合保鮮劑在一定程度上抑制了蛋白質等物質的分解，且隨著時間的增加抑制效果越明顯。因此在第6天以后，pH值低于對照組；且隨著貯藏時間的增加，兩者差距逐漸增大。

2.2.5 復合保鮮劑處理對真空包裝冷藏金鯧魚片質構指標的影響

復合保鮮劑處理對真空包裝冷藏金鯧魚片質構指標的影響情況見表4。

表4 真空包裝金鯧魚片冷藏期間質構指標的變化Table 4 Changes in texture index of vacuum packed golden pompano fillets during cold storage

質構測定指標包括硬度、彈性及咀嚼力，一般數(shù)值越大說明魚肉質地越好[17]。魚體死后，隨著糖原的分解和乳酸的積聚，腺苷三磷酸（adenosine trip-hosphate，ATP）的活躍，硬度會逐漸上升，即僵硬期；由于魚體內微生物的大量繁殖，引起腐敗變質從而導致蛋白質空間結構遭到破壞[31]，隨著含氮物質的分解，硬度會下降，出現(xiàn)軟化等。彈性和咀嚼力是評價肉口感的兩個指標，由表4可以看出，復合保鮮劑組的硬度、彈性和咀嚼力都高于空白組（P＜0.05），說明復合生物保鮮劑處理，能夠抑制金鯧魚片質構特性的改變，有著優(yōu)于對照組的質地和口感。

2.2.6 低磁場核磁共振（low-fieldnuclear magnetic resonance，LF-NMR）測定金鯧魚片水分變化結果

利用低磁場核磁分析不同貯藏時間下金鯧魚肌肉組織內不同水分分布，來推測復合保鮮劑的保水效果，并與不做處理的空白對照組相比較，不同貯藏時間低磁場核磁共振（LF-NMR）橫向弛豫時間T2的反演情況見圖5。

圖5 真空包裝金鯧魚片冷藏期間橫向弛豫時間的變化Fig.5 Changes in transverse relaxation time of vacuum packed golden pompano fillets during cold storage

LF-NMR反演后的弛豫圖有3個峰，區(qū)間分別處于T21（1 ms～10 ms）、T22（10 ms～100 ms）和T23（100 ms～1 000 ms），反映出魚肉中水分存在的3種狀態(tài)，T21為蛋白質分子表面的極性基團與水分子緊密結合的結合水；T22代表肌肉中存在于肌纖絲、肌原纖維及細胞膜之間的不易流動水；T23表示存在于細胞外間隙中可自由流動的水。其中T22代表魚肉網(wǎng)狀結構中水分的滯留能力，含量一般在90%左右，占肌肉中水分的絕大部分，為水分的主要存在形式。圖5顯示，復合保鮮劑組和空白對照組T22總體變化趨勢是貯藏初期峰較高，6 d～8 d有所下降，10 d后有所上升，后期基本趨于平穩(wěn)（對照組的第14天時T22峰較高，可能因為對照組在10 d時已經(jīng)腐敗變質，導致14 d測量結果可能有些偏差），比較而言，復合保鮮劑組的T22峰值普遍高于空白對照組，顯示出較好的保水效果。T21、T22、T23各峰與橫坐標面積的百分比可以代表水分含量（以A21、A22、A23來表示），峰面積的差異代表不同狀態(tài)水的比例[32]，其中不易流動水A22所占比例越大則樣品的保水性越好。金鯧魚片冷藏期間水分含量的變化結果見表5。

表5 真空包裝金鯧魚片冷藏期間水分含量的變化Table 5 Changes in moisture content of vacuum packed golden pompano fillets during cold storage

從表5中可以看出，復合保鮮劑組和空白對照組A22總體變化趨勢是第4天稍有升高，8 d左右下降，后期有所上升，但基本趨于平穩(wěn)，而且復合保鮮劑組的A22水分含量總體高于空白對照組，自由水A23含量低于對照組，說明復合保鮮劑具有較好的保水能力。袁乙平等[33]采用低磁場核磁共振技術研究牦牛肉經(jīng)真空包裝后于4℃貯藏過程中水分的變化時發(fā)現(xiàn)，T22、T23峰面積不斷減少，說明不易流動水和自由水隨著貯藏時間的延長不斷減少，與本研究結論相似，只是本研究復合保鮮劑組10 d后水分含量A22總體變化趨于平穩(wěn)，下降趨勢不明顯，A23總體低于對照組，說明復合保鮮劑組具有較好的保水性能，減少了不易流動水向自由水的流失。

3 結論

通過正交試驗，確定了復合保鮮劑的最優(yōu)配方為茶多酚用量0.25 g/kg、殼聚糖用量4 g/kg、ε-聚賴氨酸鹽酸鹽用量0.25 g/kg復配。最優(yōu)復合保鮮劑處理后可以延緩金鯧魚的腐敗變質，能將4℃真空包裝金鯧魚片的一級鮮度和貨架期均延長4 d左右；硬度、彈性、咀嚼力明顯升高；低磁場核磁顯示，復合保鮮劑的保水性能顯著優(yōu)于對照組。因此，本研究所得復合保鮮劑最優(yōu)配方可以應用于金鯧魚及其它水產品的貯藏保鮮。