冠狀支架植入對血管平滑肌細(xì)胞力生長因子影響的研究

李天助，盧妮敏，陳柯涵，林英忠，李今朝

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000；2.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，廣西 南寧 530000；3.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧 錦州 121000)

大量的臨床結(jié)果表明，PTCA術(shù)后有一定比例的支架內(nèi)再狹窄(in-stent restenosis，ISR)現(xiàn)象發(fā)生，尤其是術(shù)后3～6個月內(nèi)在再狹窄率曾高達(dá)30%[1]。心血管支架置入后引發(fā)的支架內(nèi)再狹窄已經(jīng)成為PTCA術(shù)推廣應(yīng)用中的一個重要問題，人們一直致力于支架再狹窄的研究。

目前研究表明，支架術(shù)后再狹窄的主要因素包括：病變的特點(diǎn)、患者自身狀況、支架本身的特性、術(shù)者的手術(shù)操作行為、術(shù)后藥物的應(yīng)用等情況。而支架術(shù)后再狹窄的生理基礎(chǔ)是內(nèi)皮的增生和平滑肌細(xì)胞的正性重構(gòu)。而支架或球囊擴(kuò)張，引發(fā)的血管平滑肌牽張和牽張后的平滑肌過度增生，是冠狀動脈正性重構(gòu)和冠脈支架術(shù)后再狹窄的重要機(jī)制。因此，對機(jī)械牽張后引發(fā)的冠脈血管平滑肌細(xì)胞基因表達(dá)，和平滑肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化，的研究對防治支架再狹窄的發(fā)生有著十分重要的意義。

力生長因子(mechano growth factor，MGF)是一種IGF-1變體，由Igf-1基因剪接變異產(chǎn)生，其特征是比IGF-1的羧基端多出延伸肽(extention peptide，E肽)，研究發(fā)現(xiàn)MGF是力學(xué)敏感因子。表達(dá)量受到拉伸刺激的調(diào)控。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MGF能激活衛(wèi)星細(xì)胞、促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖，參與損傷肌肉組織的修復(fù)與再生；在心肌梗死的治療中，能降低永久缺血損傷面積和增加存活面積；在修復(fù)神經(jīng)損傷與維持骨質(zhì)量和修復(fù)骨損傷等方面有重要的作用。而作為MGF作用的重要靶器官的冠脈血管內(nèi)平滑肌細(xì)胞的增生增值一定會受到MGF表達(dá)水平的影響。并在機(jī)械支架牽張后的平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化中其重要作用，有深入研究的必要。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

采用Sprague-Dawley(SD)犬(來源于遼寧醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心)，雄性，體重21.6～24.7 kg，于實(shí)驗(yàn)條件下飼養(yǎng)1 w。隨機(jī)分成兩組，每組7只，分別命名為支架植入組(于冠狀動脈內(nèi)植入不銹鋼材料支架)、對照組(與支架植入組完全相同的操作過程，只是不對冠狀動脈植入支架)。

1.2 檢測指標(biāo)及方法

1.2.1 冠狀動脈造影

應(yīng)用德國西門子公司DTA造影機(jī)進(jìn)行冠狀動脈造影，造影前4 h給予阿斯匹林片100 mg口服，波立維片75 mg口服，建立靜脈通路，嚴(yán)格無菌操作，碘伏消毒股動脈穿刺部位，行右股動脈剖開術(shù)，暴露右股動脈并穿刺，植入6F鞘管，鞘肝素2000單位，應(yīng)用多功能造影導(dǎo)管行左冠狀動脈造影。

1.2.2 冠狀動脈支架植入

在造影完成后補(bǔ)肝素至4000單位，延造影導(dǎo)管送入BMW導(dǎo)絲至前降支遠(yuǎn)端，送入支架3 mm×16 mm以20 atm釋放，造成過度牽拉植入模型(suoshik模型)。術(shù)后給予口服阿斯匹林片100毫克/日，口服波立維片75毫克/日，口服立普妥20毫克 /日。術(shù)后6 h給予每日2次皮下注射低分子肝素鈣0.4單位。造影結(jié)束結(jié)扎股動脈，縫合包扎。

1.2.3 血液中MGF、VEGF水平檢測：

于術(shù)前、術(shù)后48 h和術(shù)后1個月采動物靜脈血，2000 rpm離心，取上清液，應(yīng)用博士德公司TNF檢查酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，按說明書進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.2.4 冠脈血管平滑肌細(xì)胞中MGFmRNA表達(dá)檢測

于支架植入后1個月行股動脈拋開放血法處死動物，開胸，暴露心臟，于主動脈弓處離斷心臟血管，應(yīng)用生理鹽水灌注冠狀動脈前降支，待無血液后，灌注5%福爾馬林液固定。石蠟包埋，檢測前脫蠟，應(yīng)用武漢博士德公司的TNF原位雜交試劑盒，應(yīng)用原位雜交法檢測冠狀動脈支架植入部位的MGFmRNA的表達(dá)，mRNA表達(dá)檢測免疫組化試劑盒(SANTA公司)說明進(jìn)行操作。對圖片進(jìn)行半定量分析(在200～400倍顯微鏡下，計(jì)算上、中、下、左、右5個視野陽性著色，用平均灰度代表陽性表達(dá)，灰度值測定的是透光度0～250之間，灰度值越高表達(dá)越弱。

1.2.5 MGF蛋白水平檢測

應(yīng)用Westernblot法檢測蛋白水平。裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，MGF蛋白測定試劑盒(北京威盛生物制品公司)測定蛋白濃度后，取50 μg樣品蛋白進(jìn)行12%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酞胺(SDS-PAGE)凝膠變性電泳，然后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，加入小鼠抗人Fas單克隆抗體(Sigma公司)，37 ℃，l h，洗滌后加掃描圖像，用隨機(jī)附帶軟件Odyssey 1.1計(jì)算強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 支架植入后內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀測

(1)取材：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康娜〔?，要求部位?zhǔn)確，體積小于2 mm；(2)醛類固定：用2%～3%的戊二醛固定2 h；(3)清洗：用磷酸緩沖液清洗3次，每次10 min；(4)鋨酸固定：用1%～2%的鋨酸固定2～3 h；(5)清洗：用磷酸緩沖液清洗3次，每次10 min；(6)脫水：用50%、70%、80%、90%乙醇梯度脫水各15 min，再用100%乙醇脫水3次，每次30 min；(7)置換：用環(huán)氧丙烷或丙酮置換3次，每次30 min；(8)浸漬：10 h以上，浸漬過程如下：丙酮，包埋劑=3∶1的浸漬液浸漬(動物樣品1 h，植物樣品2～3 h)；丙酮，包埋劑=1∶1的浸漬液浸漬(動物樣品1 h，植物樣品2～3 h)；丙酮，包埋劑=1∶3的浸漬液浸漬(動物樣品4 h，植物樣品12～24 h)；純包埋劑浸漬(動物樣品4 h，植物樣品12～24 h)；(9)包埋：將樣品放入盛有純包埋劑的包埋板中；包埋劑配方中Epon812MNA，DDSA，DMP-30的比例；(10)聚合：將包埋板置于40 ℃、60 ℃條件下各聚合48 h；修塊：將包埋頭修成梯形，且樣品表面積小于0.2 mm×0.2 mm；超薄切片：切片厚度50～90 nm；染色：鈾染色5～15 min清洗鉛染色5～10 min清洗；3名病理科醫(yī)生背對背觀測。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間行t檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 支架植入即刻造影結(jié)果

冠狀動脈介入治療后即刻造影結(jié)果顯示各組動物支架植入順利無狹窄及撕裂，timi血流3級，見圖1、2、3。

圖1 冠狀動脈支架植入圖2 冠狀動脈支架植入圖3 冠狀動脈支架植入

2.2 支架植入1個月后冠狀動脈內(nèi)膜病理組織學(xué)檢測

1個月后處死動物光鏡下可見：不銹鋼支架植入組冠脈血管發(fā)生顯著的內(nèi)膜增生、腔內(nèi)血栓形成并伴有平滑肌增生。對照組無上述變化，見圖4、5。

圖4 1個月后對照組無明顯異常所見 圖5 支架植入組，冠狀動脈血管內(nèi)皮和平滑肌明顯增生

2.3 支架植入后1個月冠狀動脈血管電鏡檢測

支架植入后1個月對各組冠狀動脈行電鏡檢測發(fā)現(xiàn)：對照組內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)良好，無明顯細(xì)胞器的腫大，線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)良好；支架植入組后卻表現(xiàn)為：內(nèi)皮細(xì)胞增生不良、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)紊亂、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)解體，見圖6、7、8。

2.4 1個月后支架植入部位炎細(xì)胞浸潤情況

支架植入組，植入部位明顯炎細(xì)胞浸潤，對照組無明顯炎細(xì)胞浸，見圖9、10、11、12。

圖6 對照組冠狀動脈內(nèi)皮和平滑肌電鏡檢測

圖9 對照組100倍 圖10 支架植入組100倍

圖11 對照組200倍 圖12 支架植入組200倍

2.5 血液中MGF水平比較

血液中MGF水平比較，見表1。

表1 術(shù)前術(shù)后血液中MGF水平比較

2.6 支架植入1個月后平滑肌細(xì)胞MGF的mRNA表達(dá)水平

支架植入組MGF的mRNA表達(dá)明顯高對照組，見表2、圖13、14。

表2 支架植入組和對照組MGF的mRNA基因表達(dá)水平

圖13 對照組 圖14 支架組

2.7 1個月后平滑肌細(xì)胞MGF的蛋白表達(dá)

免疫印跡結(jié)果可以看到，支架置入組平滑肌細(xì)胞中MGF蛋白的表達(dá)水平(99.93±16.77)明顯高于對照組(31.63±9.86)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=8.730，P<0.01)，見圖15。

圖15 支架組及對照組平滑肌細(xì)胞MGF蛋白免疫印跡

表3 平滑肌細(xì)胞MGF蛋白表達(dá)水平

3 討 論

隨著生活方式的改變，人類患病普也在發(fā)生著巨大的改變。冠心病已經(jīng)成為首要的疾病，取代腫瘤成為第一位的疾病。冠心病心肌梗死則成為了威脅人類生命的首位殺手。冠心病的防治已迫在眉睫。冠心病是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的簡稱，其病理基礎(chǔ)是冠狀動脈的粥樣硬化，由于巨噬細(xì)胞吞噬了大量的脂質(zhì)物質(zhì)在冠狀動脈內(nèi)皮下形成粥樣物質(zhì)的沉積，粥樣物外面包裹著纖維組織帽。由于斑塊的存在造成官腔的狹窄，引發(fā)其支配的心肌處于缺血狀態(tài)，并使得冠狀動脈儲備減低，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺血，引起活動后胸痛和心肌疾病的發(fā)生。如果斑塊破裂將導(dǎo)致急性血管閉塞，引發(fā)急性心肌梗死，危及患者生命。

隨著生活方式的改變，人類患病普也在發(fā)生著巨大的改變.由原來的傳染性疾病，向營養(yǎng)性疾病改變。高血壓、冠心病、糖尿病等代謝性疾病的發(fā)病率正逐年增高。其中冠心病已經(jīng)成為首要的疾病，在疾病的發(fā)病中取代腫瘤成為第一位的疾病。冠心病心肌梗死則成為了威脅人類生命的首位殺手，冠心病的防治已迫在眉睫。冠心病是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的簡稱，其病理基礎(chǔ)是冠狀動脈的粥樣硬化，由于巨噬細(xì)胞吞噬了大量的脂質(zhì)物質(zhì)在冠狀動脈內(nèi)皮下形成粥樣物質(zhì)的沉積，粥樣物外面包裹著纖維組織帽。由于斑塊的存在造成官腔的狹窄，引發(fā)其支配的心肌處于缺血狀態(tài)，并使得冠狀動脈儲備減低，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺血，引起活動后胸痛和心肌疾病的發(fā)生。如果斑塊破裂將導(dǎo)致急性血管閉塞，引發(fā)急性心肌梗死，危及患者生命。目前冠心病心肌梗死已經(jīng)成為威脅人類生命的首要?dú)⑹帧?/p>

藥物治療不能使已經(jīng)形成的斑塊消失。因此，對斑塊的人為干預(yù)成為治療冠心病的有效手段。在對冠脈板塊的干預(yù)手段中又以經(jīng)皮穿刺冠狀動脈成形術(shù)(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)最為常見?，F(xiàn)在全世界每年約有1500萬名心血管病患者需要接受先進(jìn)的經(jīng)皮穿刺冠狀動脈成形術(shù)(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)[1]1767-1780，其中約80%在患者置入了心血管支架。由于PTCA具有微創(chuàng)傷、高效性等優(yōu)點(diǎn)，在狹窄心血管內(nèi)置入支架已成為心肌血運(yùn)重建的主要手段，并迅速發(fā)展成為目前治療心血管狹窄引發(fā)冠心病的一種有效方法。

但大量的臨床結(jié)果表明，PTCA術(shù)后有一定比例的支架內(nèi)再狹窄(in-stent restenosis，ISR)現(xiàn)象發(fā)生，尤其是術(shù)后3～6個月內(nèi)在再狹窄率曾高達(dá)30%[2]。心血管支架置入后引發(fā)的支架內(nèi)再狹窄已經(jīng)成為PTCA術(shù)推廣應(yīng)用中的一個重要問題，人們一直致力于從根本上解決這一問題。研究人員對ISR發(fā)生機(jī)制的不斷深入研究表明，支架置入后造成的血管壁損傷引發(fā)的動脈平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)過度增殖、遷移和變性，以及支架附近的血栓形成是導(dǎo)致ISR發(fā)生的兩個主要原因[3]。研究結(jié)果表明，冠動脈血管損傷后，受損內(nèi)膜下的物質(zhì)暴露于血液中，導(dǎo)致血小板的激活；血小板通過釋放凝血酶激活更多的血小板，引發(fā)生長因子的釋放，促使細(xì)胞間成分發(fā)生改變，介導(dǎo)VSCM過度增殖并由中膜向內(nèi)膜遷移。VSCM發(fā)生表型的改變，從具有收縮功能的細(xì)胞分化成具有分泌功能的細(xì)胞，分泌細(xì)胞外基質(zhì)，從而形成新生內(nèi)膜，導(dǎo)致血管的內(nèi)膜變厚。在此過程中，過多的血小板還啟動了凝血機(jī)制而形成血栓。以上這些因素共同導(dǎo)致支架內(nèi)VSMC的過度增殖、遷移、變性以及血栓的形成，最終引發(fā)支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生[4-5]。

為了能夠有效降低心血管支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生率，許多研究都集中在對支架進(jìn)行表面改性處理方面，包括：藥物涂層[6-7]、內(nèi)皮化處理[8-9]、基因涂層[10-11]和放射化處理[12]等，但是，每種方法均還存在一定的弊端。因此，人們?nèi)云惹行枰环N性能安全可靠和穩(wěn)定持久，并能有效抑制支架內(nèi)再狹窄的新型心血管支架。

但是無論什么材料的支架，都需要進(jìn)行釋放擴(kuò)張，將對冠脈血管產(chǎn)生不可避免的牽張，作為機(jī)械性損傷必然會帶來局部的炎癥反應(yīng)和相應(yīng)內(nèi)皮細(xì)胞特別是平滑肌細(xì)胞的增生，引發(fā)血管的正性重構(gòu)，是引發(fā)支架植入術(shù)再狹窄的最根本一環(huán)，而目前醫(yī)學(xué)界把解決再狹窄的重點(diǎn)，都放到了解決支架的材料學(xué)上，而忽視了機(jī)械牽張對血管平滑肌結(jié)構(gòu)和相關(guān)基因表達(dá)的影響。因此，對支架植入的機(jī)械牽張?jiān)倨交〗Y(jié)構(gòu)和基因表達(dá)上的影響進(jìn)行深入的研究，很有必要，可能成為解決支架再狹窄的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

力生長因子(mechano growth factor，MGF)是一種IGF-1變體，由Igf-1基因剪接變異產(chǎn)生，其特征是比IGF-1的羧基端多出延伸肽(extention peptide，E肽)，研究發(fā)現(xiàn)MGF是力學(xué)敏感因子。表達(dá)量受到拉伸刺激的調(diào)控。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MGF能激活衛(wèi)星細(xì)胞、促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖，參與損傷肌肉組織的修復(fù)與再生；在心肌梗死的治療中，能降低永久缺血損傷面積和增加存活面積；在修復(fù)神經(jīng)損傷與維持骨質(zhì)量和修復(fù)骨損傷等方面有重要的作用。而作為MGF作用的重要靶器官的冠脈血管內(nèi)平滑肌細(xì)胞的增生增值一定會受到MGF表達(dá)水平的影響。并在機(jī)械支架牽張后的平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化中起重要作用，有深入研究的必要。