黑曲霉生長最低水分活度研究*

周志云，楊 靜，李 翠，胡 科，楊曉莉△

（1. 陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，陜西 西安 710061； 2. 陜西盛德泰林生物安全技術(shù)檢測有限公司，陜西 西安 710061）

水分含量是反映藥品質(zhì)量安全和穩(wěn)定的一個重要參數(shù)［1-4］。水分活度（Aw）是指食品或藥品等物質(zhì)在密閉容器中達(dá)到平衡狀態(tài)時的水分蒸氣壓與該溫度下純水的飽和蒸氣壓的比值［4-5］。微生物的生長必須有水，但結(jié)合在分子內(nèi)的水不能被微生物利用，只有游離的水才能被利用［6］，故采用水分活度來表示能被微生物利用的實(shí)際含水量，控制水分活度可抑制微生物的生長。各類不同的微生物與水分活度的關(guān)系主要體現(xiàn)在臨界點(diǎn)上，低于此臨界點(diǎn)，微生物不能生長［7］。通過不同的介質(zhì)優(yōu)化產(chǎn)品處方，設(shè)計和控制藥品的水分活度，可降低微生物增殖的風(fēng)險?！睹绹幍洹肥状问蛰d水分活度測定應(yīng)用于非無菌制劑微生物控制的章節(jié)［8］，將其成功引入制藥工業(yè)藥品微生物控制，但目前《中國藥典》對相關(guān)內(nèi)容收載較少。黑曲霉為曲霉屬真菌中的一個常見種屬，廣泛分布于世界各地的糧食、植物性產(chǎn)品和土壤中，其生長適溫為28 ℃左右，最低相對濕度為88%，能引起水分較高的糧食霉變和其他工業(yè)器材霉變。黑曲霉可運(yùn)用在藥物發(fā)酵中，如在甘草發(fā)酵過程中可提高甘草甜素的提取率，但若生產(chǎn)不當(dāng)，則會產(chǎn)生致癌性的黃曲霉毒素［9-10］。本研究中應(yīng)用氯化鈉、甘油、葡萄糖3 種不同介質(zhì)調(diào)節(jié)玫瑰紅鈉瓊脂的水分活度值，以降低黑曲霉可利用的“游離水”程度，從而達(dá)到使黑曲霉不再繁殖、生長停滯的目的，并探討黑曲霉生長所需的最低水活度值?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器、菌種與試藥

1.1 儀器

Aqualab Series 4 型水分活度儀（美國Decagon 公司）；HFsafe-1200 LC 型生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；BS2202S 型電子分析天平（德國賽多利斯公司，精度為0.01 g）；IPP260 型霉菌培養(yǎng)箱（德國Memmer 公司）。

1.2 菌種

黑曲霉Aspergillus niger 標(biāo)準(zhǔn)菌株購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，試驗用菌株為第3 代。

1.3 試藥

沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，批號為170316）；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，批號為181124）；甘油（批號為20180730），氯化鈉（批號為20170308），D（ + ）-無水葡萄糖（批號為20180109），聚山梨酯80（批號為20180821），均由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 菌液制備

將黑曲霉接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）上，25 ℃培養(yǎng)7 d，加入5 mL 含0.05%聚山梨酯80 的無菌0.9% 氯化鈉溶液，洗脫孢子，收集孢子懸液，用含0.05%聚山梨酯80 的無菌0.9%氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液，移至無菌試管內(nèi)，用無菌0.9%氯化鈉溶液制備成每1 mL 含黑曲霉104cfu 的孢子懸液。

2.1.2 培養(yǎng)基制備

玫瑰紅鈉平皿制備：分別稱取氯化鈉、甘油、D（ +）-無水葡萄糖，調(diào)節(jié)玫瑰紅鈉培養(yǎng)基的水分活度至TL（0.76），T（0.77），TH（0.78），即黑曲霉生長的水分活度限值為0.77，用不同介質(zhì)調(diào)節(jié)玫瑰紅鈉培養(yǎng)基，使滅菌后的培養(yǎng)基的水分活度至最低水分活度附近3 個水平（即低于水分活度限值0.01 單位、水分活度限值、高于水分活度限值0.01 單位），同時配制不調(diào)節(jié)水分活度的玫瑰紅鈉培養(yǎng)基T0。

不同環(huán)境水分活度制備：稱取氯化鈉、甘油、無水葡萄糖，置純化水中，調(diào)節(jié)各溶液水分活度至0.76，0.77，0.78，與玫瑰紅鈉瓊脂平皿水分活度相同。將121 ℃滅菌15 min 后的氯化鈉、甘油、無水葡萄糖溶液置密封干燥器中，制備不同環(huán)境水分活度儲存環(huán)境。

2.1.3 水分活度測定

預(yù)培養(yǎng)：無菌操作將濾膜正面朝上，貼于未調(diào)節(jié)水分活度滅菌后的玫瑰紅鈉瓊脂平板上。將制備好的菌液用接種針點(diǎn)植于濾膜中心位置，25 ℃預(yù)培養(yǎng)48 h。

觀察、轉(zhuǎn)移與分組：待菌落生長至直徑為5～10 mm時，分別測量濾膜垂直的2 個直徑，取平均值，2 次測量差值不超過2 mm，記為初始大小。在生物安全柜內(nèi)將菌落連同濾膜小心轉(zhuǎn)移至制備好的不同梯度水分活度的玫瑰紅鈉瓊脂平板上。TL（0.76），T（0.77），TH（0.78）為試驗組；T0為對照組（0.95～0.97）。

培養(yǎng)：將滅菌后含有不同水分活度的鹽、甘油、無水葡萄糖溶液倒入干燥器內(nèi)，將玫瑰紅鈉平皿置含有相同水分活度鹽、甘油、無水葡萄糖溶液的密閉干燥器內(nèi)，置25 ℃培養(yǎng)、觀察。采取水分活度儀-露點(diǎn)/冷面鏡法直接測定調(diào)節(jié)水分活度［11］，于0，3，7，11，15，19，23，27，31 d 時分別測量并記錄菌落大小。每個驗證試驗分別進(jìn)行3 次。

2.2 結(jié)果

2.2.1 氯化鈉培養(yǎng)介質(zhì)

以氯化鈉為介質(zhì)，考察周期為31 d，記錄黑曲霉在0.76，0.77，0.78 水分活度下菌落的生長情況。結(jié)果未調(diào)節(jié)水分活度的玫瑰紅鈉瓊脂平板（對照組）的黑曲霉生長不受環(huán)境影響，第3 天超出測量范圍；其余3 組玫瑰紅鈉瓊脂平板均調(diào)節(jié)水分活度，已接種黑曲霉的濾膜轉(zhuǎn)移至平板，前3 d，菌落處于適應(yīng)階段，有不同程度的增長，3 d 后，菌落逐漸趨于平穩(wěn)。水分活度低于0.77時，3 組黑曲霉菌絲均未出現(xiàn)增長情況。當(dāng)水分活度調(diào)節(jié)至0.78 時，第1 次實(shí)驗觀察至第23 天，黑曲霉菌絲直徑增長0.5 mm；第2 次實(shí)驗觀察至第31 天，黑曲霉菌絲直徑未增長；第3 次實(shí)驗觀察至第27 天，黑曲霉菌絲直徑增長了1 mm。詳見圖1 A。因此，以氯化鈉調(diào)節(jié)水分活度來控制黑曲霉的增長有顯著效果，水分活度控制在0.77 以下時，黑曲霉的增長處于停滯狀態(tài)。

2.2.2 甘油培養(yǎng)介質(zhì)

以甘油為介質(zhì)，考察周期為31 d，記錄黑曲霉在0.76，0.77，0.78 不同水分活度下菌落的生長情況。結(jié)果，未調(diào)節(jié)水分活度的玫瑰紅鈉瓊脂平板（對照組）的黑曲霉生長不受環(huán)境影響，第3 天超出測量范圍；其余3 組玫瑰紅鈉瓊脂平板均調(diào)節(jié)水分活度，已接種黑曲霉的濾膜轉(zhuǎn)移至平板，前3 d，菌落處于適應(yīng)階段，有不同程度的增長，3 d 后，菌落逐漸趨于平穩(wěn)。水分活度低于0.77 時，3 組黑曲霉菌絲均未出現(xiàn)增長情況。當(dāng)水分活度為0.78 時，第1 次實(shí)驗觀察至第15 天，黑曲霉菌絲呈現(xiàn)增長趨勢，至第29 天，菌絲直徑增長了1.5 mm；第2 次實(shí)驗觀察至第25 天，黑曲霉菌絲呈增長趨勢，至第31 天菌絲直徑增長了1.0 mm；第3 次實(shí)驗觀察至第29 天，黑曲霉菌絲呈現(xiàn)增長趨勢，至第31 天菌絲直徑增長了1.5 mm。詳見圖1 B。因此，以甘油調(diào)節(jié)水分活度來控制黑曲霉的增長，水分活度控制在0.77 以下時，黑曲霉的增長處于停滯狀態(tài)；水分活度在0.78 時，菌絲雖有增長，但變化不大，直徑只有1～1.5 mm 的增長。

2.2.3 D（ + ）-無水葡萄糖培養(yǎng)介質(zhì)

以D（ + ）-無水葡萄糖為介質(zhì)，考察周期為31 d，記錄黑曲霉在0.76，0.77，0.78 不同水分活度下菌落的生長情況。結(jié)果，未調(diào)節(jié)水分活度的玫瑰紅鈉瓊脂平板（對照組）的黑曲霉生長不受環(huán)境影響，第3 天超出測量范圍，其余3 組玫瑰紅鈉瓊脂平板均調(diào)節(jié)水分活度，已接種黑曲霉的濾膜轉(zhuǎn)移至平板，前3 d，菌落處于適應(yīng)階段，有不同程度的增長，3 d 后，菌落逐漸趨于平穩(wěn)。水分活度低于0.76 時，3 組黑曲霉菌絲均未出現(xiàn)增長情況。當(dāng)水分活度調(diào)節(jié)至0.77 時，第1 次實(shí)驗觀察至第23 天，黑曲霉菌絲呈現(xiàn)增長趨勢，至第31 天菌絲直徑增長了8mm；第2 次實(shí)驗觀察至第13 天，黑曲霉菌絲呈增長趨勢，至第31 天菌絲直徑增長了1.5 mm；第3 次實(shí)驗觀察至第19 天，黑曲霉菌絲呈現(xiàn)增長趨勢，至第31 天菌絲直徑增長了1 mm。當(dāng)水分活度調(diào)節(jié)至0.78 時，第1 次實(shí)驗觀察至第7 天，黑曲霉菌絲呈現(xiàn)增長趨勢，至第31 天菌絲直徑增長了13mm；第2 次實(shí)驗觀察至第17 天時黑曲霉菌絲呈現(xiàn)增長趨勢，至第31 天菌絲直徑增長了3 mm；第3 次實(shí)驗觀察至第9 天，黑曲霉菌絲呈現(xiàn)增長趨勢，至第31 天菌絲直徑增長了1 mm。詳見圖1 C。因此，以D（ + ）-無水葡萄糖調(diào)節(jié)水分活度來控制黑曲霉的增長，水分活度控制在0.76 以下時，黑曲霉的增長處于停滯狀態(tài)；水分活度在0.77 以上時，菌絲呈增長趨勢。

圖1 不同培養(yǎng)介質(zhì)下3 種水分活度黑曲霉生長情況（ n=3）

3 討論

以氯化鈉為介質(zhì)調(diào)節(jié)水分活度為0.76～0.78 時，黑曲霉菌落直徑均無明顯變化。以甘油為介質(zhì)調(diào)節(jié)水分活度為0.76～0.77 時，菌落直徑無明顯變化；水分活度為0.78 時，菌落直徑增長1～2 mm。D（ + ）-無水葡萄糖為介質(zhì)調(diào)節(jié)水分活度為0.76 時，菌落直徑無明顯變化；水分活度為0.77～0.78 時，黑曲霉菌落直徑增長3～10 mm。不同介質(zhì)條件下，黑曲霉最低水分活度存在差異，其中氯化鈉調(diào)節(jié)下的黑曲霉菌落增長不明顯，但通過甘油及葡萄糖調(diào)節(jié)后，水分活度在0.78 時即出現(xiàn)增長趨勢?？梢姡ㄟ^氯化鈉調(diào)節(jié)能獲得最低的黑曲霉生長水分活度值。

黑曲霉菌絲測定采用的培養(yǎng)基為SDA，使用D（ +）-無水葡萄糖調(diào)節(jié)SDA 水活度平板不凝，分析原因可能是SDA 培養(yǎng)基處方中含有大量的葡萄糖［12］。但在配制水分活度為0.76 的SDA 平板時，需在原處方基礎(chǔ)上添加較大量的葡萄糖，這改變了培養(yǎng)基的特性，導(dǎo)致試驗無法繼續(xù)。經(jīng)過各種試驗研究后選用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，解決了水分活度較低的情況下平板不凝的問題。

在藥品生產(chǎn)領(lǐng)域，尤其是中藥材、中藥飲片、中藥顆粒經(jīng)常在運(yùn)輸及貯存過程中發(fā)生霉變［13］。因此，在非無菌藥品的配方開發(fā)和保質(zhì)期研究中引入水分活度的概念十分有必要［14-15］，通過不同的介質(zhì)優(yōu)化產(chǎn)品處方，設(shè)計和控制藥品的水分活度，降低微生物增殖的風(fēng)險是發(fā)展趨勢。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)水分活度不超過0.76 時，黑曲霉菌落生長處于停滯期，這與文獻(xiàn)［8］的研究結(jié)果基本一致。