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    乳桿菌表層蛋白理化性質(zhì)與生物功能的研究進(jìn)展

    2020-09-10 11:38:06王艷陽康媛媛章紹兵
    關(guān)鍵詞:菌體表層病原菌

    孟 珺,王艷陽,康媛媛,章紹兵

    河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院,河南 鄭州 450001

    表層蛋白普遍存在于革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌和古生菌中,由許多相同的(糖)蛋白亞基組成,分子質(zhì)量為40~200 kDa,在菌體表層呈現(xiàn)出均勻多空孔的狀態(tài)[1]。多種乳桿菌例如嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、短乳桿菌(L.brevis)、布氏乳桿菌(L.buchneri)、高加索乳桿菌(L.kefir)、瑞士乳桿菌(L.helveticus)和卷曲乳桿菌(L.crispatus)等都已被證實(shí)具有表層蛋白,分子質(zhì)量較小,僅為25~71 kDa,等電點(diǎn)9.35~10.40,為堿性蛋白,占細(xì)胞總蛋白含量的10.0%~15.0%[2]。大部分表層蛋白都是非糖基化的,目前只發(fā)現(xiàn)L.kefir和L.brevis的表層蛋白具有糖基[3-4]。

    亞基之間以及表層蛋白與細(xì)胞壁之間通過非共價(jià)鍵連接,高濃度的解離劑如氯化鋰、鹽酸胍或SDS(十二烷基硫酸鈉)等可以提取表層蛋白。提取的表層蛋白中通常包括一些表面相關(guān)蛋白,可通過改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法去除表面相關(guān)雜質(zhì)蛋白,從而得到純度較高的表層蛋白[5]。剝離菌體的乳桿菌表層蛋白仍具有自組裝特性,可以在水油界面、固體支持物和懸浮液中通過熵驅(qū)動(dòng)重新組裝,該特性使表層蛋白在等孔超濾膜、疫苗載體和分子固定化的基質(zhì)等方面具有廣泛的應(yīng)用。乳桿菌表層蛋白對(duì)其菌體的表面疏水性、表面電荷、自聚集和共聚集能力有一定的貢獻(xiàn),還可以保護(hù)菌體免受外界環(huán)境因素(如滲透壓、抗菌肽、輻射和環(huán)境pH值的變化)的影響[6]。除此之外,乳桿菌表層蛋白還可提供細(xì)胞外大分子的黏附位點(diǎn),參與乳桿菌抑制病原菌的黏附。乳桿菌表層蛋白通過與腸上皮細(xì)胞的相互作用競(jìng)爭(zhēng)性阻斷腸道致病菌尤其是大腸桿菌、傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌和單核增生李斯特菌等高危致病菌的黏附,激活多種信號(hào)通路保護(hù)宿主免受致病菌的感染[7],但具體的機(jī)制仍需深入的研究。作者對(duì)近年來乳桿菌表層蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)、生物學(xué)功能、應(yīng)用等方面的研究進(jìn)行了綜述。

    1 乳桿菌表層蛋白的基本性質(zhì)

    從許多文獻(xiàn)報(bào)道中可以發(fā)現(xiàn),來源于不同乳桿菌菌株的表層蛋白其分子質(zhì)量大小存在差異。如表1所示,L.kefir表層蛋白的分子質(zhì)量范圍為66~71 kDa,L.brevis表層蛋白的分子質(zhì)量范圍為46~48 kDa,L.acidophilus表層蛋白的分子質(zhì)量都在46 kDa左右。這說明親緣性較遠(yuǎn)的乳桿菌表層蛋白的分子質(zhì)量存在較大差異,親緣性相近的乳桿菌表層蛋白分子質(zhì)量則具有相似性。此外,目前發(fā)現(xiàn)的所有菌株中L.kefir表層蛋白的分子質(zhì)量最大,推測(cè)與其含有糖基有關(guān)。

    典型的表層蛋白主要由酸性、疏水的氨基酸殘基組成,乳桿菌表層蛋白的疏水性氨基酸含量高達(dá)31.9%~38.7%。帶羥基的氨基酸含量也比較高,為23.0%~33.0%。其中帶正電荷的氨基酸遠(yuǎn)高于帶負(fù)電荷的氨基酸,這可能是乳桿菌表層蛋白等電點(diǎn)偏堿性的原因[8]。盡管不同乳桿菌表層蛋白的氨基酸組成相似,但其在結(jié)構(gòu)上具有多樣性。乳桿菌表層蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、延伸主鏈和無規(guī)則卷曲組成,而且大部分α-螺旋都位于表層蛋白N端。L.acidophilus的表層蛋白的α-螺旋含量為34.0%左右,β-折疊含量為12.0%左右,L.kefir的表層蛋白的α-螺旋含量為13.6%~21.0%,β-折疊含量為23.0%~42.1%,研究發(fā)現(xiàn)聚集性與非聚集性的L.kefir表層蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成存在差異,聚集性L.kefir的表層蛋白的β-折疊為23.0%~28.0%,非聚集性菌株為36.0%~42.1%。表明不同菌株表層蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)之間存在差異,這種差異性不僅表現(xiàn)在不同種間,在同種的不同菌株之間的表層蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)之間也存在差異,這可能與編碼表層蛋白的基因的數(shù)量與序列有關(guān)。

    除了二級(jí)結(jié)構(gòu),乳桿菌表層蛋白的熱變性溫度之間也存在差異性。利用差示掃描量熱法(DSC)測(cè)定乳桿菌表層蛋白的熱變性溫度,發(fā)現(xiàn)L.kefir表層蛋白一般具有兩個(gè)熱變性溫度區(qū)間,67.2~81.5 ℃和110.4~118.7 ℃,但也有例外,L.kefirCIDCA 8344只有一個(gè)熱變性溫度為81.5 ℃。L.acidophilus的熱變性溫度一般在64.0 ℃左右,但L.acidophilusCICC 6074存在兩個(gè)熱變性溫度,分別為38.0 ℃和92.0 ℃。表明來源不同的乳桿菌表層蛋白的熱變性溫度不具有普遍一致性。Mobili等[9]利用FTIR檢測(cè)在相變溫度下表層蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化,發(fā)現(xiàn)表層蛋白的熱變性溫度與其二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。在DSC檢測(cè)的過程中,隨著溫度的增加,表層蛋白的無規(guī)則卷曲和β-折疊結(jié)構(gòu)增加。此外,進(jìn)一步分析表明,聚集性和非聚集性的乳桿菌表層蛋白都在一個(gè)與它們所含β-折疊大致相關(guān)的溫度下,進(jìn)行了主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)重組。非聚集性乳桿菌的表層蛋白比聚集性乳桿菌的表層蛋白的熱變性溫度更高,可能與β-折疊含量有關(guān)。表1中L.brevisATCC 8287表層蛋白的β-折疊含量較高,具有更高的熱變性溫度,表明β-折疊含量高的表層蛋白結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定,熱變性溫度更高。

    表1 乳桿菌表層蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

    2 乳桿菌表層蛋白的提取與純化

    Hoodwink[18]在1953年首次通過電子顯微鏡觀察到蛇形螺菌(Spirillumserpens)的表層蛋白,之后陸續(xù)在古細(xì)菌和其他細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)表層蛋白。迄今為止,多種高濃度解離劑已被報(bào)道可用于提取乳桿菌表層蛋白,比如鹽酸胍、氯化鋰、氫氧化鈉和尿素等[19],但不同提取劑的提取效果有較大差異。與鹽酸胍相比,氯化鋰可以更有效地和選擇性地提取表層蛋白,去除菌體表面超過90%的表層蛋白,且不會(huì)導(dǎo)致菌體失活,提取效果更好[20]。Zhang等[15]對(duì)L.acidophilusCICC 6074表層蛋白的提取方法進(jìn)行改進(jìn),分別利用不同濃度、不同pH值的氯化鋰和尿素提取表層蛋白,發(fā)現(xiàn)pH 2.0的5 mol/L氯化鋰為最佳提取劑。至今,5 mol/L氯化鋰溶液仍是較多報(bào)道中常用的表層蛋白提取劑。

    上述單一解離劑提取的表層蛋白通常含有一些雜蛋白,所以需要采用適宜的純化方法以得到高純度的表層蛋白。Johnson等[21]發(fā)現(xiàn)5 mol/L氯化鋰提取的L.acidophilusNCFM的表層蛋白中共包含37種蛋白,其中一些蛋白可以與表層復(fù)合物松散地結(jié)合或嵌入其中,稱為表層相關(guān)蛋白。通過改進(jìn)實(shí)驗(yàn)條件,利用5 mol/L氯化鋰提取表層蛋白,將提取液透析,沉淀由1 mol/L氯化鋰復(fù)溶,電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種提取方法可以去除表層相關(guān)雜質(zhì)蛋白,獲得純度較高的表層蛋白。除此之外,還可通過親和層析、離子交換色譜、凝膠過濾色譜和高效液相色譜純化表層蛋白。Zhang等[15]利用SephadexG-75色譜法分離L.acidophilusCICC 6074的表層蛋白粗提物,在28 min時(shí)出現(xiàn)明顯的洗脫峰,收集產(chǎn)物SDS-PAGE后發(fā)現(xiàn)在46 kDa處有清晰的單一條帶,證明得到了純化的表層蛋白。與其他提取方法相比,該方法操作簡(jiǎn)便,對(duì)填料要求不嚴(yán)苛,純化過程中保證了表層蛋白的生物活性,為進(jìn)一步利用其活性奠定基礎(chǔ)。

    3 乳桿菌表層蛋白的生物功能

    3.1 菌表層蛋白對(duì)其菌體益生特性的影響

    乳桿菌是益生菌的一大類,攝入足夠數(shù)量時(shí)會(huì)給宿主帶來健康益處,乳桿菌的存活量是其發(fā)揮益生作用的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)乳桿菌表層蛋白可增加乳桿菌在消化道內(nèi)的存活率,已有研究證明L.acidophilusNCFM的表層蛋白提高了菌體的耐酸耐膽鹽能力,增強(qiáng)了對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附,對(duì)菌體黏附腸道組織產(chǎn)生有益影響[22]。酸性條件下,L.plantarumATCC 14917的表層蛋白的表達(dá)量則增加,黏附能力增強(qiáng)以保護(hù)菌體[23]。而在高鹽條件下,L.acidophilusATCC 4356的表層蛋白SlpA和SlpX的表達(dá)量增加以降低滲透壓對(duì)嗜酸乳桿菌的脅迫,從而增加菌體的存活率[24]。這表明表層蛋白對(duì)乳桿菌具有保護(hù)作用,保證乳桿菌的存活率,延長(zhǎng)乳桿菌在腸道內(nèi)發(fā)揮益生作用的時(shí)間。

    表層蛋白對(duì)乳桿菌的多種表面性質(zhì)具有積極的影響,這些性質(zhì)對(duì)乳桿菌的黏附能力又有著較大的貢獻(xiàn)[7]。其中,表面疏水作用和表面電荷是乳桿菌非特異性黏附的主要作用力。有研究報(bào)道,失去表層蛋白后,L.acidophilusNCFM的表面疏水性增大,表面電荷變少,乳桿菌的黏附能力下降[16]。這表明表層蛋白可以改變?nèi)闂U菌的表面性質(zhì)從而具有非特異性提高乳桿菌黏附,有利于乳桿菌益生特性的發(fā)揮。

    表層蛋白可通過自動(dòng)聚集形成生物膜,不僅可以加強(qiáng)黏附、利于定植,而且形成的空間位阻能夠阻礙致病菌的黏附,從而有利于乳桿菌益生特性的發(fā)揮[25]。有研究發(fā)現(xiàn),去除表層蛋白后,L.acidophilusNCFM、L.acidophilusFB11、L.caseizhang和L.gasseriFB8的自聚集與共聚集能力和黏附Hela細(xì)胞的能力均有顯著下降,推測(cè)表層蛋白參與乳桿菌的自聚集與共聚集,并增強(qiáng)乳桿菌的黏附能力[16]。Meng等[13]研究發(fā)現(xiàn)去除表層蛋白后,乳桿菌細(xì)胞對(duì)大腸桿菌侵襲HT-29細(xì)胞的抑制能力明顯降低,表明乳桿菌表層蛋白可以抑制致病菌的黏附和侵襲。

    3.2 乳桿菌表層蛋白介導(dǎo)其菌體黏附腸道組織

    乳桿菌與宿主的相互作用主要與菌體表層蛋白、脂磷壁酸和胞外多糖等有關(guān),其中表層蛋白含量的增加可以增強(qiáng)菌體對(duì)腸道組織的黏附,這與表層蛋白本身的黏附性有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)乳桿菌可通過表層蛋白黏附于宿主的不同組織,L.acidophilusM92可通過表層蛋白黏附于上皮細(xì)胞[26]。L.acidophilusKLDS 1.0901可利用表層蛋白黏附在十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸中,利用氯化鋰處理菌體后,乳桿菌的黏附能力顯著降低[27]。L.brevisD6中也發(fā)現(xiàn)去除表層蛋白后菌體對(duì)纖連蛋白、膠原蛋白和層粘連蛋白的黏附力降低[28],表明乳桿菌表層蛋白調(diào)控乳桿菌的黏附,然而氯化鋰提取表層蛋白的過程中,可能去除了其他與黏附相關(guān)的細(xì)胞壁蛋白,因此該研究結(jié)果存在爭(zhēng)議。在剝離表層蛋白的L.kefirCIDCA 8348和L.kefirCIDCA 83115的菌液中加入其表層蛋白提取物后,菌體對(duì)胃黏液素和小腸黏液素的黏附能力顯著增加[29],說明乳桿菌的黏附特性與表層蛋白密切相關(guān)。除此之外,通過敲除表層蛋白基因也證明乳桿菌表層蛋白介導(dǎo)乳桿菌的黏附,將L.acidophilusNCFM的表層蛋白基因敲除后發(fā)現(xiàn),菌株失去體外黏附黏蛋白和纖維蛋白的能力,證明了表層蛋白參與了乳桿菌的黏附[26]。Hyn?nen等[30]將L.brevisATCC 8287的表層蛋白SlpA基因的不同區(qū)域與大腸桿菌fliCH7基因的可變區(qū)域融合,由此產(chǎn)生的嵌合鞭毛從成熟的表層蛋白(大小為435個(gè)氨基酸)中插入多達(dá)275個(gè)氨基酸。結(jié)果表明,該鞭毛可以結(jié)合到人的上皮細(xì)胞和纖維結(jié)合蛋白上,這說明L.brevisATCC 8287的表層蛋白SlpA具有黏附特性。進(jìn)一步研究表明,表層蛋白作為中間黏附素,連接上皮細(xì)胞和纖連蛋白的連接區(qū)域在表層蛋白的N-末端部分的81個(gè)氨基酸的片段內(nèi)。

    3.3 乳桿菌表層蛋白抑制致病菌引起的細(xì)胞凋亡

    目前有研究報(bào)道稱致病性大腸桿菌在侵染宿主后,細(xì)胞中的caspase-3(半胱氨酸蛋白酶-3)和鈣蛋白酶可激活大腸桿菌分泌的自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EspC,誘導(dǎo)感染細(xì)胞的凋亡和壞死[31-32]。先前的研究已經(jīng)證明乳桿菌表層蛋白可減少病原菌引起的細(xì)胞凋亡,研究發(fā)現(xiàn)將L.acidophilusATCC 4356、L.salivariusZJ614、L.brevisATCC 14869、L.helveticusATCC 12046和L.kefirJCM 5818的表層蛋白對(duì)細(xì)菌預(yù)處理可降低致病菌引起的細(xì)胞凋亡[33-35]。

    許多學(xué)者對(duì)乳桿菌表層蛋白抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行了研究,Guo等[14]提取L.acidophilusCICC 6074的表層蛋白與TNF-α感染的Caco-2細(xì)胞共同孵育,發(fā)現(xiàn)表層蛋白可抑制細(xì)胞中caspase-3活性,降低促炎因子IL-6的分泌,通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)減少沙門氏菌引起的Caco-2細(xì)胞凋亡。此外,還有研究發(fā)現(xiàn)L.paracaseiM7的表層蛋白與感染沙門氏菌的HT-29細(xì)胞共同培養(yǎng)后,caspase-3的活性降低,細(xì)胞凋亡減少[36]。caspase-3是蛋白水解中一個(gè)關(guān)鍵的caspase調(diào)控因子,caspase可導(dǎo)致凋亡細(xì)胞死亡,并在凋亡的執(zhí)行階段裂解許多結(jié)構(gòu)蛋白,L.paracaseiM7的表層蛋白抑制細(xì)胞凋亡的潛在機(jī)制可能與表層蛋白抑制caspase-3活化途徑有關(guān)。Meng等[37]研究表明L.acidophilusNCFM的表層蛋白減少了大腸桿菌和沙門氏菌引起的HT-29細(xì)胞中的染色質(zhì)縮聚,維持了線粒體膜電位和Ca2+水平,并且抑制了caspase-9和caspase-3的活化。這些結(jié)果表明,L.acidophilusNCFM表層蛋白可以通過線粒體介導(dǎo)的途徑保護(hù)HT-29細(xì)胞免受腸道病原菌誘導(dǎo)的凋亡。

    此外,表層蛋白還可以通過激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1和2(ERK 1/2)信號(hào)通路以減少凋亡。腸黏膜修復(fù)功能是通過ERK 1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的,它維持上皮細(xì)胞屏障的完整性[38]。L.acidophilusATCC 4356的表層蛋白與Caco-2細(xì)胞孵育一段時(shí)間后,磷酸化的ERK 1/2的活性顯著增加。研究還發(fā)現(xiàn)傷寒沙門氏菌可激活ERK 1/2,表層蛋白可通過ERK 1/2信號(hào)修飾損傷的細(xì)胞,除此之外,還可誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖和分化延遲致病菌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[39]。

    3.4 抑菌、抗病毒

    黏附是病原菌入侵細(xì)胞的第一步,病原菌可黏附于腸道黏膜誘導(dǎo)腹瀉,引起腸道細(xì)胞損傷對(duì)人體造成傷害,抑制病原菌的黏附可減少其對(duì)宿主的侵襲[40]。研究發(fā)現(xiàn)L.acidophilus的表層蛋白可顯著抑制傷寒沙門氏菌的黏附與入侵[39]。Meng等[13]選擇L.helveticusfb213、L.acidophilusfb116和L.acidophilusfb214為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)去除表層蛋白后乳桿菌細(xì)胞對(duì)大腸桿菌侵襲HT-29細(xì)胞的抑制能力明顯降低。這些結(jié)果表明,表層蛋白可以協(xié)助乳桿菌抑制病原菌的黏附和侵襲。

    乳桿菌表層蛋白抑制病原菌的機(jī)制可能與表層蛋白與免疫細(xì)胞相互作用誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)有關(guān)。L.acidophilusNCK2187的表層蛋白SlpA可與C型凝集素SIGNR3結(jié)合,誘導(dǎo)結(jié)腸炎中先天性細(xì)胞和T細(xì)胞極化,參與免疫反應(yīng)從而減輕病原性炎癥結(jié)腸炎,維持健康的胃腸道微生物群,并保護(hù)腸道黏膜屏障[41]。乳桿菌表層蛋白可通過相應(yīng)受體激活信號(hào)通路,從而引起細(xì)胞因子的合成和分泌的改變,如IL10、IL12分泌增加,IL1、TNF-α、IL-1β、IL8和NF-κB等分泌減少,促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞骨架結(jié)合以及緊密連接蛋白的合成等以調(diào)控免疫應(yīng)答抑制病原菌的侵襲。研究發(fā)現(xiàn),L.acidophilusNCFM表層蛋白可通過MAPK和NF-κB信號(hào)通路減弱TNF-α、IL-1β和活性氧(ROS)的產(chǎn)生。免疫印跡分析結(jié)果表明,表層蛋白還可阻斷IκBα磷酸化,抑制NF-κB p65易位到細(xì)胞核激活炎癥基因轉(zhuǎn)錄,減少上皮細(xì)胞的促炎反應(yīng),參與免疫應(yīng)答抑制炎癥反應(yīng)[42]。Gao等[35]研究表明,L.acidophilusATCC 4356的表層蛋白通過降低HA(血凝素)和NA(神經(jīng)氨酸酶)mRNA表達(dá)以及NP(核蛋白)蛋白表達(dá),抑制H9N2病毒入侵樹突狀細(xì)胞。表層蛋白還可刺激IFN-1信號(hào)傳導(dǎo)途徑激活樹突狀細(xì)胞的活化,并上調(diào)促炎因子IL-10的分泌調(diào)控免疫應(yīng)答,緩解炎癥過程,抑制H9N2病毒的感染。

    表層蛋白還可以通過其水解酶活性抑制病原菌,L.acidophilusNCFM和L.acidophilusfb11的表層蛋白均使大腸桿菌的生長(zhǎng)受到抑制,使病原菌處于細(xì)胞壁受損,細(xì)胞膜暴露的亞致死損傷狀態(tài),該特性似乎可以擴(kuò)展到該種的其他菌株[43]。此外,乳桿菌表層蛋白還可與乳鏈菌肽協(xié)同抑制致病菌,乳鏈菌肽不能抑制革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng),而L.acidophilusATCC 4356的表層蛋白與乳鏈菌肽協(xié)同作用可導(dǎo)致病原菌死亡,從而抑制革蘭氏陰性致病菌與革蘭氏陽性致病菌的生長(zhǎng)[44]。在L.crispatus菌株中也發(fā)現(xiàn)SlpB與乳鏈菌肽的協(xié)同作用會(huì)增強(qiáng)抑制腐生葡萄球菌能力,結(jié)果表明,SlpB和乳鏈菌肽的結(jié)合導(dǎo)致ATP或紫外吸收材料的釋放,通過破壞膜的完整性導(dǎo)致跨膜電位的突然耗散,從而達(dá)到協(xié)同抑菌的作用[45]。

    DC-SIGN(DC特異性細(xì)胞間黏附分子-3結(jié)合非整合素因子)是一種細(xì)胞表面黏附因子,可形成四聚體識(shí)別病毒表面的甘露糖和巖藻糖與病原菌進(jìn)行多價(jià)相互作用,增強(qiáng)病原體的入侵。HIV1型、丙型肝炎病毒、埃博拉病毒、巨細(xì)胞病毒和登革熱病毒等極易感染DC-SIGN[46-47]。研究發(fā)現(xiàn),乳桿菌表層蛋白與DC-SIGN之間的相互作用可在體外阻斷DC-SIGN受體抑制病毒的黏附[48]。原因可能是DC-SIGN-病原體復(fù)合物對(duì)pH值敏感,等電點(diǎn)較高的乳桿菌表層蛋白可通過蛋白結(jié)構(gòu)和靜電力干擾鈣依賴型病毒與宿主的相互作用。此外,糖基化的表層蛋白還可直接與凝集素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)抑制致病菌,由于DC-SIGN介導(dǎo)的病原菌相互作用涉及到對(duì)多種病原菌上表達(dá)的聚糖的識(shí)別,糖基化表層蛋白中的聚糖可能與病原菌競(jìng)爭(zhēng)DC-SIGN凝集素上的CRD(碳水化合物識(shí)別域)抑制病原菌的定植[34]。這些結(jié)果表明,乳桿菌表層蛋白可以保護(hù)細(xì)胞,防止病原菌與DC-SIGN結(jié)合侵染細(xì)胞。

    4 應(yīng)用

    乳桿菌表層蛋白具有獨(dú)特的特性,如高度有序的結(jié)構(gòu)、自組裝功能、獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)和良好的益生功能等,使得表層蛋白在食品、材料和醫(yī)藥領(lǐng)域有著較為廣泛的應(yīng)用(表2)。但與其他革蘭氏陽性菌相比,有關(guān)乳桿菌表層蛋白的研究相對(duì)較少。

    表2 乳桿菌表層蛋白的特征和應(yīng)用

    4.1 在食品領(lǐng)域的應(yīng)用

    腐生葡萄球菌是奶酪、原料奶和干香腸等食品中的主要微生物。最近的研究發(fā)現(xiàn)腐生葡萄球菌存在致病性,是一種新興的病原體,因此,需要開發(fā)新的抑菌劑。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)L.crispatusK313的表層蛋白可與乳酸鏈球菌肽作為抑菌劑,協(xié)同作用控制葡萄球菌引起的食物腐敗。Sun等[45]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),L.crispatusK313的表層蛋白SlpB和乳酸鏈球菌肽的協(xié)同作用可以滅活細(xì)菌,不僅抑制初始接種物中培養(yǎng)物的生長(zhǎng),還在預(yù)培養(yǎng)中引起病原體的死亡。這表明乳酸鏈球菌肽+SlpB是一種潛在的新型抗菌組合物,可作為抑菌劑用于食品保鮮。除了用作抑菌劑外,乳桿菌表層蛋白基于食品抑制炎癥和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的干預(yù)方法受到了極大的關(guān)注。Wang等[42]發(fā)現(xiàn)L.acidophilusNCFM表層蛋白通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)維持人體健康,表層蛋白通過抑制MAPK和NF-κB信號(hào)通路減弱促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和活性氧(ROS)的產(chǎn)生,以減弱脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中的炎癥反應(yīng),維持腸道健康。表層蛋白作為一種潛在的免疫調(diào)節(jié)生物活性蛋白,有望用作功能性食品中的添加劑調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)維持人體健康。

    4.2 在納米材料中的應(yīng)用

    乳桿菌表層蛋白可在許多界面上自組裝成納米級(jí)的單分子層,而且攜帶功能分子的表層蛋白可以在固體、懸浮液或液體表面重新自組裝成規(guī)則的納米結(jié)構(gòu),這一特點(diǎn)可應(yīng)用于傳感器、電子器件和電泳涂層等納米材料的開發(fā)應(yīng)用。

    4.2.1 生物傳感器

    乳桿菌表層蛋白晶格可將生物受體連接到換能界面,增大生物傳感器的信號(hào)。表層蛋白晶格的超薄和高度多孔的結(jié)構(gòu)、特定的官能團(tuán)和整體防污特性可顯著提高生物受體固定的種類量和易用性,為生產(chǎn)更高效更便宜的生物傳感器奠定理論基礎(chǔ)[50]。

    4.2.2 電子器件

    數(shù)字電子系統(tǒng)的廣泛進(jìn)步引發(fā)了對(duì)這些系統(tǒng)小型化和開發(fā)具有優(yōu)異性能材料的迫切需求。乳桿菌表層蛋白因其低分子質(zhì)量、生物相容性和自組裝特性成為硅基器件的潛在替代品,Moudgil等[51]發(fā)現(xiàn)乳桿菌表層蛋白可代替硅基器件用于制造電子存儲(chǔ)器件。他們首先將L.brevisATCC 8287的表層蛋白與功能化的ITO底物在4.0 ℃下孵育過夜固定表層蛋白,底物使用氧化銦錫/聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(ITO/PET)柔性底物,其中表層蛋白膜沉積在ITO上。然后從該柔性器件的半部分蝕刻出表層蛋白,作為電子器件的接地端,ITO作為表層蛋白/ITO/PET結(jié)構(gòu)上的底部電極。研究發(fā)現(xiàn)該表層蛋白柔性電子存儲(chǔ)器件具有雙穩(wěn)態(tài)記憶特性、環(huán)境穩(wěn)定性,可多次彎曲和較長(zhǎng)的保留時(shí)間,在智能手環(huán)等可穿戴存儲(chǔ)應(yīng)用中具有廣泛的潛力。

    4.2.3 電泳涂層

    由于乳桿菌表層蛋白的自組裝特性以及所帶化學(xué)基團(tuán),表層蛋白可以在疏水性的玻璃毛細(xì)血管表面重新結(jié)合形成一種新的毛細(xì)管電泳涂層。該涂層在堿性條件下仍可使用,在pH 12.3的氫氧化鈉溶液中仍保持穩(wěn)定。SlpA包被的毛細(xì)血管用于分離人血清中的脂蛋白,分離效果良好且可以多次使用[49]。

    4.3 在醫(yī)療方面的應(yīng)用

    4.3.1 表面展示系統(tǒng)

    乳桿菌表層蛋白可用于在乳桿菌中形成表面展示系統(tǒng),該系統(tǒng)可用于診斷、靶向遞送抗原、篩選肽庫和開發(fā)生物催化劑。研究發(fā)現(xiàn)L.brevisATCC 8287的SlpA和L.brevisATCC 367的SlpE的N-末端結(jié)構(gòu)域LVIS-2083和eGFP標(biāo)記蛋白組成融合蛋白,已經(jīng)證明融合蛋白SlpA-eGFP和LVIS-2083-eGFP以及重組LVIS-2083蛋白具有特異性地吸附在L.brevisATCC 8287、L.brevisATCC 367和L.acidophilusATCC 4356菌株細(xì)胞壁上的能力。使用基于SlpA和LVIS-2083蛋白的N-末端細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)建的融合蛋白,可以創(chuàng)建在乳桿菌屬菌株的細(xì)胞壁表面上展示蛋白質(zhì)的系統(tǒng)[52]。

    4.3.2 包被脂質(zhì)體

    除了上述提到的利用乳桿菌表層蛋白在乳桿菌中形成的表面展示系統(tǒng)在醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用外,利用表層蛋白的自組裝性質(zhì)包被脂質(zhì)體作為藥物載體在醫(yī)療方面也具有廣闊的應(yīng)用前景。Wang等[53]利用L.helveticusCGMCC1.1877的表層蛋白包被的脂質(zhì)體可黏附于胃腸黏膜,并提高了脂膜的穩(wěn)定性。表層蛋白可在脂質(zhì)體表面重新自組裝形成包被層,改善脂質(zhì)體的功能。但不同結(jié)構(gòu)的表層蛋白對(duì)脂質(zhì)體的功能特性以及與脂質(zhì)體的相互作用機(jī)制尚不明確。乳桿菌表層蛋白分為糖基化和非糖基化兩種,結(jié)構(gòu)的差異會(huì)使它們與脂質(zhì)體產(chǎn)生怎樣的相互作用則具有很大的研究空間。筆者所在實(shí)驗(yàn)室針對(duì)這一問題,選取了若干具有非糖基化表層蛋白的乳桿菌(如L.acidophilus、L.crispatus)和若干具有糖基化表層蛋白的乳桿菌(如L.buchneri、L.kefir)作為研究的代表菌株,提取乳桿菌表層蛋白,對(duì)不同表層蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)進(jìn)行解析,并將表層蛋白包被于陽離子脂質(zhì)體,分析表層蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)差異對(duì)脂質(zhì)體穩(wěn)定性的影響及存在的規(guī)律,揭示不同結(jié)構(gòu)乳桿菌表層蛋白與脂質(zhì)體的互作機(jī)理,以期為乳桿菌表層蛋白在脂質(zhì)體領(lǐng)域的應(yīng)用提供一些理論基礎(chǔ)。

    5 結(jié)論

    大多數(shù)細(xì)菌和古生菌中都存在表層蛋白,不同來源的乳桿菌表層蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)存在著較大的差異,而且乳桿菌表層蛋白的某些性質(zhì)不具有普遍一致性。如前文提到的不同乳桿菌的表層蛋白黏附、抑菌和抗病毒的機(jī)制不同,現(xiàn)在雖然對(duì)表層蛋白的黏附、抑菌和抗病毒的機(jī)制有所了解,但還有很多機(jī)理尚未研究,如乳桿菌表層蛋白是否只通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)抑制致病菌引起細(xì)胞凋亡。表層蛋白還可協(xié)助乳桿菌發(fā)揮多種益生功能,其良好的益生功能和獨(dú)特的結(jié)構(gòu)性質(zhì),可應(yīng)用于食品保鮮、研發(fā)生物傳感器、開發(fā)包被材料以及結(jié)合免疫分子開發(fā)疫苗等。乳桿菌表層蛋白更多的生物功能及應(yīng)用還有待未來進(jìn)一步的探索。

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