外泌體生物標(biāo)志物在卵巢癌診斷及預(yù)后評估方面的價值
——系統(tǒng)評價

李耀威，李力

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是世界范圍內(nèi)普遍高發(fā)且死亡率較高的惡性腫瘤，該疾病每年在全世界造成超過15萬人死亡，死亡率居婦科惡性腫瘤之首[1-2]。OC患者的5年生存率不到30%，主要是其缺乏早期明確診斷的相關(guān)技術(shù)及治療期間腫瘤極易出現(xiàn)抗癌藥物耐藥性。此外，OC是一種異質(zhì)性疾病，患者之間在分子水平上存在差異。這些差異通常意味著同一處理方案可能對一些患者有效，但對同一臨床及病理分期分型的另一些患者的病情控制效果較差甚至無效。鑒于OC發(fā)生、發(fā)展過程的復(fù)雜性及對高效診治技術(shù)的迫切需要，學(xué)者們一致認為，多層次、多角度對OC的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤細胞生物學(xué)調(diào)控機制進行深入研究從而達到準(zhǔn)確、高效診斷及靶向治療OC的目的有重要推動作用。

近年關(guān)于外泌體的研究受到學(xué)術(shù)界廣泛關(guān)注。外泌體在腫瘤細胞間信號通訊傳導(dǎo)中扮演著重要角色。各種類型的細胞皆可分泌外泌體[3]。腫瘤來源的外泌體可從原發(fā)腫瘤細胞轉(zhuǎn)移到腫瘤微環(huán)境和遠處器官，進而增強腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移[4-6]。外泌體攜帶的信息物質(zhì)[如微小RNA（miRNA或miR）、長鏈非編碼RNA（lncRNA）、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等]可反映其來源細胞的生物學(xué)特征；腫瘤患者體內(nèi)癌細胞將改變其外泌體相關(guān)信息的表達水平進而釋放到多種體液中（如血液、尿液和腹水等）。有研究提示血漿來源外泌體蛋白的濃度與OC的嚴(yán)重程度和惡性進展密切相關(guān)[7]；某些特定的外泌體標(biāo)志物可被用作相關(guān)腫瘤早期診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物[8]。本研究通過對已發(fā)表的外泌體在OC診斷及預(yù)后方面的相關(guān)研究進行系統(tǒng)評價，以期為篩選外泌體相關(guān)生物標(biāo)志物指導(dǎo)OC診斷及預(yù)后評價提供思考。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①研究中的患者必須經(jīng)病理確診為OC；②研究涉及人體生物體液來源外泌體；③研究涉及OC患者診斷和（或）預(yù)后；④根據(jù)相關(guān)指標(biāo)的表達水平，將OC患者分為高表達水平組和低表達水平組，并分析相關(guān)指標(biāo)與OC患者臨床預(yù)后之間的關(guān)系；⑤相關(guān)指標(biāo)與生存狀況相關(guān)的研究中必須對總生存期（overall survival，OS）和（或）無進展生存期（progression-free survival，PFS）進行了明確定義。排除標(biāo)準(zhǔn)：①OC來源細胞系實驗或動物實驗研究；②綜述類文章、個案報告、會議總結(jié)及短評。

1.2 文獻檢索 通過計算機檢索中國知網(wǎng)、維普、萬方、PubMed、EMBASE、Web of Knowledge和 Cochrane Library數(shù)據(jù)庫，檢索時間均為數(shù)據(jù)庫建庫至2019年12月20日。中文檢索詞包括“卵巢癌”、“卵巢惡性腫瘤”、“外泌體”、“診斷”、“預(yù)后”、“生存率”；英文檢索詞包括“ovarian cancer”、“ovarian carcinoma”、“ovarian carcinomata”、“ovarian tumor”、“ovarian tumour”、“ovarian neoplasm”、“exosomes”、“exosome”、“diagnosis”、“diagnose”、“prognosis”和“survival”。

1.3 文獻篩選和資料提取 由2名研究者按納入與排除標(biāo)準(zhǔn)獨立完成文獻篩選和資料提取，如遇分歧則通過協(xié)商解決。根據(jù)預(yù)先制定的資料提取表提取資料，資料提取內(nèi)容主要包括：①基本信息：文獻作者、文獻發(fā)表年份、研究來源（國家）、研究類型、外泌體來源、外泌體分離方法、外泌體鑒定方法、外泌體生物標(biāo)志物名稱、外泌體生物標(biāo)志物定量方法及研究目的；②診斷方面相關(guān)信息：受試者工作特征曲線下面積（areaunderthecurve，AUC）、AUC的95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）、P 值；敏感度（sensitivity）及特異度（specificity）；③預(yù)后方面相關(guān)信息：隨訪時間（follow-up time）、預(yù)后指標(biāo)（OS、PFS、5 年生存率）、風(fēng)險比（hazard ratio，HR）、HR 的 95%CI及P值。

1.4 文獻質(zhì)量評價 診斷性研究通過QUADAS量表評價納入研究的質(zhì)量，該表含有14個條目，每個條目可評價為“是（1分）”，“否（0分）”或“不清楚（0分）”，預(yù)后方面的相關(guān)研究通過紐卡斯?fàn)?渥太華量表（Newcastle-Ottawa Scale，NOS）進行文獻質(zhì)量評分。

2 結(jié)果

2.1 文獻納入情況及納入文獻基本特征 通過計算機檢索數(shù)據(jù)庫最初共獲得439篇文獻。隨后，使用EndNote X7剔除重復(fù)文獻252篇。經(jīng)過閱讀文獻題目和摘要等步驟排除明顯不相干文獻共167篇后，對剩余20篇文獻進行全文通讀及詳細評價，其中有10篇文獻（包括7篇綜述類文獻、2篇未涉及診斷或預(yù)后情況及1篇數(shù)據(jù)不完整）被進一步排除。通過手工查詢（補充檢索）未發(fā)現(xiàn)其他文獻可納入本研究，故最終納入系統(tǒng)評價的文獻共10篇，5篇涉及OC患者診斷方面的研究、6篇涉及OC患者預(yù)后方面的研究，其中1篇文獻同時涉及診斷及預(yù)后方面研究。由于納入的文獻在診斷及預(yù)后方面尚不宜進行Meta分析，故對納入的文獻進行系統(tǒng)評價。文獻檢索流程見圖1。

圖1 文獻檢索流程圖

10篇文獻[9-18]中有7篇發(fā)表時間在2016—2019年。文獻研究來源于中國4篇，其他分別來源于美國、波蘭、挪威、德國、以色列及韓國各1篇。研究類型包括5項病例-對照研究和1項病例研究，其他4篇文獻未予說明。見表1。

2.2 納入文獻的質(zhì)量評價 5篇診斷性文獻質(zhì)量評價得分均≥8分，6篇預(yù)后方面研究的文獻質(zhì)量評價均≥7分，提示本系統(tǒng)評價納入文獻的質(zhì)量整體較高，見表2和表3。

2.3 外泌體的提取純化與鑒定 本研究納入文獻中有1篇文獻[10]采用超速離心法、8篇文獻[11-18]采用外泌體提取試劑盒、1篇文獻[9]采用免疫磁珠捕獲法分離純化外泌體。對于外泌體的鑒定主要依據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定，如掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）[10]、透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）[9，14-16，18]及相關(guān)蛋白標(biāo)志物檢測如蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting，WB）鑒定標(biāo)志蛋白[12-13，17]。見表 4。

2.4 外泌體生物標(biāo)志物用于OC的診斷分析 外泌體分離提取后，需進一步檢測相關(guān)標(biāo)志物的含量，WB和酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）是研究外泌體內(nèi)含蛋白質(zhì)類標(biāo)志物的常用方法；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）是檢測外泌體內(nèi)含RNA類標(biāo)志物（如miRNA、lncRNA）的常用方法。另外，還有其他新技術(shù)：比如GeneChip miRNA array[9]。本系統(tǒng)評價納入的4項研究[12，15-17]表明，血清及血漿來源外泌體內(nèi)含相關(guān)miRNA及蛋白質(zhì)均顯示出較好的診斷潛能。例如，血清來源外泌體內(nèi)含miR-200a、miR-145顯示出較高的診斷價值（miR-200a的AUC為0.91,敏感度、特異度分別為83.9%和90.0%；miR-145的AUC為0.91，敏感度、特異度分別為91.7%和75.0%)。另外，血漿來源外泌體內(nèi)含纖維蛋白原α鏈（FGA）、凝溶膠蛋白（GSN）、纖維蛋白原 γ鏈（FGG）也具備一定的診斷價值（FGA、GSN、FGG的AUC分別為 0.85、0.83和 0.74）。見表 5。

表1 納入文獻的基本特征

表2 診斷研究質(zhì)量評價情況

表3 預(yù)后研究質(zhì)量評價情況

表4 外泌體的純化及鑒定方法

2.5 外泌體生物標(biāo)志物用于OC的預(yù)后評估 通過qRT-PCR檢測到的外泌體內(nèi)含RNA類標(biāo)志物（如miRNA、lncRNA）和WB檢測的外泌體內(nèi)含蛋白類標(biāo)志物可用于預(yù)測OC患者的預(yù)后。例如，血清來源外泌體內(nèi)含 miR-373、miR-200b、miR-200c 高表達與OC患者的OS明顯縮短密切相關(guān)（HR分別為2.1、2.7 和 2.4，95%CI分別為 1.0～4.3、1.3～5.7 和1.2～4.9）；同時miR-200c高表達與OC患者的PFS縮短也密切相關(guān)（HR=2.0，95%CI：1.1～3.6）。另外，血清來源外泌體內(nèi)含lncRNA反義缺氧誘導(dǎo)因子（aHIF）高表達與OC患者的OS縮短密切相關(guān)（HR=3.70，95%CI：1.83～7.50）。見表 6。

3 討論

目前，臨床上通常將經(jīng)陰道超聲聯(lián)合糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）檢測作為 OC是否發(fā)生的篩查方法。經(jīng)陰道超聲對卵巢和周圍器官的成像雖然較經(jīng)腹部超聲辨識度更高，但是在絕經(jīng)前很難將卵巢腫瘤與功能性囊腫區(qū)別開。CA125是一種由體腔上皮分泌的高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，可誘導(dǎo)間皮細胞和苗勒氏組織的分化，可以通過其單抗OC125在人體血清中定量CA125。研究表明，80%的上皮性卵巢癌患者血液中CA125明顯升高，由于高達50%的Ⅰ期卵巢癌患者血清中CA125水平無明顯上升，而在非卵巢惡性腫瘤的其他病理生理狀態(tài)（例如盆腔炎、腹膜炎、子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢良性囊腫、排卵期、月經(jīng)期及妊娠狀態(tài)等）和其他惡性腫瘤疾患狀態(tài)（例如膀胱癌、乳腺癌、肝癌及肺癌等）下血清CA125水平會不同程度上升，故CA125早期診斷效能不佳（敏感度僅27%～60%）[19]。一項隨機對照試驗提示，經(jīng)陰道超聲和CA125水平監(jiān)測的聯(lián)合篩查并未降低OC死亡率[20]。鑒于此，探索更為可靠的腫瘤標(biāo)志物識別早期OC和監(jiān)測OC術(shù)后患者早期復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移情況是必要的、迫切的。

腫瘤細胞間的信號物質(zhì)通訊傳遞在惡性腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮著重要作用。這些信號物質(zhì)包括遞質(zhì)、凋亡小體和細胞外囊泡（外泌體）等。鑒別出這些物質(zhì)及檢測其表達水平對臨床篩查早期腫瘤及判斷患者術(shù)后是否存在早期復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移有重要指導(dǎo)意義。近年細胞外囊泡（尤其是外泌體）的研究引起了學(xué)者們的極大興趣。外泌體是細胞主動分泌的胞外囊泡，與其他游離分子相比，外泌體能更好地表征其來源細胞的病理生理特征。目前已有相當(dāng)數(shù)量的研究表明，與正常細胞相比，腫瘤細胞會釋放更高濃度的外泌體[21-22]。同時，外泌體在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的諸多過程中都扮演著重要角色[23-26]。外泌體屬于高度穩(wěn)定的膜狀囊泡，可通過降低信噪比（signal-to-noise ratio）來提高其早期診斷腫瘤及監(jiān)測腫瘤術(shù)后患者是否存在早期復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移情況的準(zhǔn)確性[27]。

表5 用于卵巢癌診斷的外泌體生物標(biāo)志物

表6 用于評估OC預(yù)后情況的外泌體生物標(biāo)志物

本系統(tǒng)評價表明，在診斷方面，外泌體內(nèi)含miRNA在區(qū)分OC與卵巢良性腫瘤及正常人群方面有較大的潛力，例如血清外泌體內(nèi)miR-200a、miR-200c、miR-145 等[12，17]；尤其是 miR-200a、miR-145顯示出較高的診斷價值（miR-200a的AUC為0.91，敏感度和特異度分別達到83.9%和90.0%；miR-145的AUC為0.91，敏感度和特異度分別達到91.7%和75.0%）。一些外泌體內(nèi)含蛋白也具有一定的診斷價值[16]，例如血漿來源外泌體內(nèi)含蛋白FGA、GSN、FGG的AUC分別可達0.85、0.83和0.74。這些結(jié)果表明，血液來源外泌體內(nèi)容物具備診斷OC的潛力，臨床科研工作者有必要在這方面繼續(xù)深入研究進而發(fā)現(xiàn)切實高效診斷早期OC的外泌體標(biāo)志物。在指導(dǎo)卵巢癌患者生存預(yù)后方面，外泌體內(nèi)含miRNA、lncRNA均具備一定的預(yù)后指導(dǎo)意義[12，18]。例如OC患者血清來源外泌體內(nèi)含 miR-373、miR-200b、miR-200c 的高表達與OS縮短密切相關(guān)；miR-200c的高表達還與 PFS 縮短密切相關(guān)，其 HR（95%CI）為 2.0（1.1～3.6）[12]。尤其是血清來源外泌體內(nèi)含lncRNA aHIF高表達與OC患者的OS縮短密切相關(guān)（HR=3.70，95%CI：1.83～7.50）[18]。這表明對 OC 患者血液來源外泌體內(nèi)容物進行深入研究進而發(fā)現(xiàn)具有指導(dǎo)預(yù)后意義的生物標(biāo)志物可能性很大。

眾所周知，敏感度和特異度是評價診斷性試驗臨床應(yīng)用價值的最重要指標(biāo)。目前存在的問題是，鮮有在較大OC患者樣本中關(guān)于外泌體生物標(biāo)志物敏感度和特異度的報道。再者，目前人附睪蛋白4（HE4）和CA125被確立為（尚）可用于OC早期診斷和監(jiān)測復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的血清標(biāo)志物，如果發(fā)現(xiàn)某些外泌體生物標(biāo)志物可以代替目前的血清學(xué)檢測指標(biāo)（HE4、CA125），那么其敏感度和特異度至少應(yīng)高于目前水平才更有價值。是否確實存在這樣的外泌體生物標(biāo)志物，尚需展開大量的臨床研究進行論證。

OC是一種異質(zhì)性疾病已是一個不爭的事實，即使是處于相同TNM分期（T：原發(fā)灶，N：淋巴結(jié)，M：遠處轉(zhuǎn)移）的患者接受相同的治療方案，他們的預(yù)后情況也不盡相同，因此預(yù)測哪些患者將從哪些治療方案（尤其是化學(xué)療法和新輔助化學(xué)療法）中受益是非常重要的。在這種情況下，可能需要檢測OC患者體液來源的外泌體生物標(biāo)志物以協(xié)助臨床醫(yī)師判斷哪些患者將從新輔助化療中受益，而其他患者更適合選擇其他治療方案。晚期OC患者的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險更高，臨床醫(yī)師應(yīng)進行更頻繁的監(jiān)測以指導(dǎo)其對相關(guān)患者進行醫(yī)學(xué)干預(yù)。

綜合本系統(tǒng)評價的結(jié)果來看，在OC患者體液來源的外泌體內(nèi)含物中發(fā)現(xiàn)一種或多種（甚至多類）差異表達且能有效識別早期OC發(fā)生及評估OC患者預(yù)后情況的生物標(biāo)志物（如miRNA、lncRNA、蛋白質(zhì)等）是很有可能的，尤其是目前關(guān)于外泌體內(nèi)含物lncRNA在OC中的研究報道尚少，這為研究人員選擇在這一亞方向進行深入研究提供了廣闊空間。

當(dāng)然，目前外泌體的研究及應(yīng)用尚存許多挑戰(zhàn)[28-30]。其一，雖然目前有多種分離純化外泌體的方法，但其優(yōu)劣勢均較明顯。哪些技術(shù)更適用于外泌體標(biāo)志物的診斷及監(jiān)測尚未達成共識，目前最常用的技術(shù)是超速離心法和排阻色譜法（size exclusion chromatography，SEC），但這兩種方法均會導(dǎo)致外泌體中富含其他生物雜質(zhì)（如可溶性蛋白、脂蛋白等）。多種方法的聯(lián)合應(yīng)用，比如SEC和密度梯度離心法相結(jié)合可以幫助去除脂蛋白，從而提高外泌體純度[31-32]；利用包被抗標(biāo)志物抗體（如CD63、CD9蛋白）的磁珠與外泌體囊泡孵育結(jié)合，可將外泌體吸附、分離出來并可以大大提高所得外泌體的純度[31]，可以部分克服目前存在的問題，但離滿足下游實驗的要求仍存在差距。其二，從不同來源（性質(zhì)）的體液中純化外泌體也面臨著多種挑戰(zhàn)[32]，許多外在因素可能影響外泌體生物標(biāo)志物（如miRNA、蛋白質(zhì)等）的含量[33]。比如，不同來源的生物體液（血清、血漿、腹水等）的收集方法、一天中的采集時間（早、中、晚）、患者是否禁食禁飲、取材于因病情發(fā)展自然而成的腹水或是腹腔灌洗液等這些因素均可能影響其生物標(biāo)志物的表達種類及表達水平。因此，也需要更多的研究來確定這些外在因素對外泌體標(biāo)志物檢測的影響，并且應(yīng)該逐步形成統(tǒng)一的認識及標(biāo)準(zhǔn)的程序來減小這些外在因素對相關(guān)診斷結(jié)果的影響。