DNA損傷應(yīng)答通路抑制劑治療卵巢癌的研究進(jìn)展

王柯若，李慧鍇，秦宇

卵巢癌由于典型癥狀和體征出現(xiàn)較晚，而且缺乏有效的篩查手段和早期診斷方法，5年生存率低于45%，目前的主要治療策略為減瘤術(shù)聯(lián)合鉑類等化學(xué)療法，但是其復(fù)發(fā)率較高且預(yù)后不良[1]。與其他惡性腫瘤類似，卵巢癌的病理生理學(xué)受到廣泛研究，并且 DNA 損傷應(yīng)答（DNA damage response，DDR）通路相關(guān)蛋白激酶的畸變對(duì)腫瘤的形成及發(fā)展起到重要作用，因而針對(duì)DDR途徑設(shè)計(jì)的抑制劑為卵巢癌的靶向治療提供了新思路[2]。

在細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中，胞內(nèi)DNA會(huì)受到各種內(nèi)源性、外源性刺激作用而受損，如堿基損傷、單鏈斷裂（single-strand break，SSB）、雙鏈斷裂（doublestrand break，DSB）等[3]。目前引起DNA損傷主要包括兩種途徑，一是正常代謝過(guò)程障礙導(dǎo)致的內(nèi)源性損傷，如產(chǎn)生副產(chǎn)物活性氧簇、復(fù)制錯(cuò)誤等；二是外界環(huán)境刺激作用引起的外源性損傷，如電離輻射、化學(xué)藥物等。未修復(fù)的DNA損傷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)DNA損傷也會(huì)破壞基因組穩(wěn)定性從而影響其編碼、轉(zhuǎn)錄能力[3]?；蚪M穩(wěn)定性對(duì)于基因組的正常復(fù)制至關(guān)重要，為了減少DNA損傷對(duì)細(xì)胞的危害，細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)化出多種機(jī)制進(jìn)行DDR，包括堿基切除修復(fù)（base excision repair，BER）、錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair，MMR）、非同源末端連接（non-homologous end recombination，NHEJ）和同源重組（homologous recombination，HR）等[4]。腫瘤細(xì)胞通常伴有DDR途徑缺陷，DDR缺陷會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性，從而通過(guò)積累突變成為導(dǎo)致癌癥發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一。目前，已經(jīng)研發(fā)了多種利用DDR通路缺陷來(lái)治療癌癥的藥物，開發(fā)此類靶向DDR抑制劑的前提是此類藥物能導(dǎo)致DNA損傷，并靶向腫瘤細(xì)胞特征性改變[5]。本文主要對(duì)DDR途徑有代表性的激酶抑制劑的作用機(jī)制及治療卵巢癌的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對(duì)其應(yīng)用前景加以討論。

1 聚 ADP核糖聚合酶 [Poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]抑制劑

1.1 PARP抑制劑的作用機(jī)制 PARP是哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞中一種關(guān)鍵的DNA修復(fù)酶，具有參與DDR、促進(jìn)腫瘤相關(guān)炎癥反應(yīng)、DNA甲基化、調(diào)控細(xì)胞能量代謝及凋亡等生理功能。目前，至少有17種不同類型的蛋白質(zhì)被確定為PARP家族成員，其中只有PARP-1、PARP-2、PARP-3具有DNA修復(fù)的功能[6]。細(xì)胞中最常見(jiàn)的兩種DNA損傷形式為SSB和DSB。SSB主要通過(guò)BER途徑進(jìn)行修復(fù)，DSB則主要通過(guò)HR和NHEJ兩種途徑進(jìn)行DNA修復(fù)。HR是細(xì)胞周期G2期高度活躍的一種高保真的修復(fù)途徑，修復(fù)錯(cuò)誤率低，是細(xì)胞內(nèi)主要的修復(fù)形式；NHEJ則主要通過(guò)G1/S轉(zhuǎn)換和S期起作用，是一種不加選擇的DNA連接形式，容易積累錯(cuò)誤而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[7]。PARP可以通過(guò)感知SSB被激活，并通過(guò)介導(dǎo)BER途徑將DNA修復(fù)酶募集到損傷位點(diǎn)修復(fù)SSB，也能通過(guò)與DSB位點(diǎn)結(jié)合并募集聚（ADP-核糖）[poly（ADP－ribose），PAR]結(jié)合 HR 蛋白通過(guò) HR 途徑修復(fù)DSB。

目前PARP抑制劑的作用機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面：協(xié)同致死效應(yīng)、對(duì)PARP的誘捕作用、阻礙BER途徑、激活NHEJ等。其中協(xié)同致死效應(yīng)是近年研究熱點(diǎn)，為抗瘤藥物的研發(fā)提供了重要思路[8]。以PARP抑制劑治療攜帶乳腺癌易感基因1/2（BRCA1/2）突變的卵巢癌為例，具體作用機(jī)制見(jiàn)圖1。DNA受到內(nèi)、外源性刺激后形成DNA SSB，PARP募集修復(fù)蛋白到損傷位點(diǎn)修復(fù)DNA SSB。當(dāng)應(yīng)用PARP抑制劑后，其與PARP的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制了修復(fù)蛋白在損傷位點(diǎn)的募集，導(dǎo)致復(fù)制叉崩解形成DNA DSB。由于BRCA1/2基因介導(dǎo)HR途徑修復(fù)DNA DSB具有重要作用，因而當(dāng)BRCA1/2基因突變時(shí)HR途徑受到抑制，DNA DSB通過(guò)NEHJ錯(cuò)誤修復(fù)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

圖1 PARP抑制劑協(xié)同致死效應(yīng)治療攜帶BRCA1/2突變的卵巢癌的機(jī)制

1.2 PARP抑制劑治療卵巢癌的研究進(jìn)展 自發(fā)現(xiàn)BRCA突變或缺陷的腫瘤細(xì)胞對(duì)PARP抑制劑敏感以來(lái)，已經(jīng)有3種藥物被美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)用于卵巢癌的治療，包括奧拉帕尼（Olaparid）、尼拉帕尼（Niraparid）以及瑞卡帕尼（Rucaparid），此外維利帕尼（Veliparib）、特拉帕尼（Ttalazoparib）正處于臨床研究階段。奧拉帕尼是研究最廣泛，也是第一個(gè)被批準(zhǔn)用于臨床治療卵巢癌的PARP抑制劑，于2014年12月被批準(zhǔn)用于攜帶胚系BRCA突變（germline BRCA mutation，gBRCAm）三線及以上、化療后晚期卵巢癌患者的維持治療；2017年8月被批準(zhǔn)用于對(duì)鉑類化療敏感的復(fù)發(fā)性上皮卵巢癌、輸卵管癌及原發(fā)性腹膜癌的維持治療。奧拉帕尼的臨床批準(zhǔn)主要基于大量Ⅲ期臨床試驗(yàn)，其中Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗(yàn)主要通過(guò)遞增劑量的藥物確定了鉑類化療與奧拉帕尼的藥物相關(guān)性，并確定了最佳劑量[9]。Ⅲ期多中心雙盲隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)（RCT）SOLO-1（NCT01844986）和 SOLO-2（NCT01874353）分別將344例新診斷的鉑類化療敏感患者和295例不攜帶BRCA突變的鉑類化療敏感復(fù)發(fā)患者隨機(jī)分為2組（2∶1）接受奧拉帕尼和安慰劑治療，其試驗(yàn)結(jié)果肯定了奧拉帕尼對(duì)鉑類化療反應(yīng)的高級(jí)別漿液性卵巢癌、輸卵管癌或原發(fā)性腹膜癌的療效[10]。SOLO-3是唯一研究奧拉帕尼單藥治療鉑類化療敏感的復(fù)發(fā)性卵巢癌患者的Ⅲ期臨床試驗(yàn)，其研究結(jié)果尚未發(fā)表。

瑞卡帕尼于2016年12月被FDA批準(zhǔn)用于攜帶BRCA突變經(jīng)過(guò)兩次及以上化療后的晚期卵巢癌患者，其批準(zhǔn)主要基于2項(xiàng)多中心RCT研究10（NCT01482715）和ARIEL2。研究10的ⅡA期試驗(yàn)主要對(duì)攜帶gBRCAm的鉑類化療敏感的復(fù)發(fā)性高級(jí)別卵巢癌患者的安全性和有效性進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示其客觀緩解率和疾病控制率分別為74%和77%，目前研究10的ⅡB和Ⅲ期試驗(yàn)正在進(jìn)行。ARIEL2主要依據(jù)雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）程度將192例患者分為BRCA突變、LOH高和LOH低3個(gè)亞組，結(jié)果表明與LOH低亞組相比，BRCA突變組和LOH高亞組的無(wú)進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）顯著延長(zhǎng)，LOH是比其他HR基因突變更加敏感的反應(yīng)預(yù)測(cè)因子[11]。ARIEL3旨在前瞻性評(píng)估與同源重組缺陷（homologous recombination defect，HRD）相關(guān)的復(fù)發(fā)性卵巢癌患者PFS的主要終點(diǎn)[12]。

尼拉帕尼于2017年3月被FDA批準(zhǔn)用于治療鉑類化療敏感的復(fù)發(fā)性上皮性卵巢癌、輸卵管癌及原發(fā)性腹膜癌的維持治療。Ⅰ、Ⅱ期試驗(yàn)主要通過(guò)遞增劑量試驗(yàn)確定其最佳劑量為每日300 mg并顯示實(shí)體瘤內(nèi)的抗癌活性[13]。其批準(zhǔn)主要基于多中心RCT試驗(yàn)NOVA，將533例對(duì)鉑類化療敏感復(fù)發(fā)患者以2∶1的比例接受尼拉帕尼和安慰劑治療，其結(jié)果表明在gBRCAm、HRD陽(yáng)性和HRD陰性3個(gè)亞組中PFS中位生存時(shí)間與安慰劑組相比均明顯延長(zhǎng)[14]。與3種批準(zhǔn)治療卵巢癌的PARP抑制劑相關(guān)的主要副作用為疲勞、貧血及惡心嘔吐，其停藥率為10%～15%。骨髓異常增生綜合征和急性髓細(xì)胞性白血病為主要的嚴(yán)重3～4級(jí)不良反應(yīng)，發(fā)生率為1%～2%[10,12,15]。

2 共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變（ataxia telangiectasia mutated，ATM）抑制劑

2.1 ATM抑制劑的作用機(jī)制 ATM是一種蛋白激酶，主要起對(duì)DSB修復(fù)應(yīng)答作用，包括DNA修復(fù)、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的激活、細(xì)胞的衰老和凋亡、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變等[16]。ATM、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張和Rad3相關(guān)蛋白（ataxia telangiectasia and Rad3 related protein，ATR） 及 DNA依賴性蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase，DNA-PK）均為磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide-3-kinase，PI3K）家族成員，在幾乎所有哺乳動(dòng)物中都大量表達(dá)，并且在DDR中起重要作用。ATM的激活機(jī)制及其與ATR、檢查點(diǎn)激酶 1（checkpoint kinase 1，CHK1）、CHK2 在 DDR通路中的作用見(jiàn)圖2。ATM主要由DNA DSB激活，激活后被MRN復(fù)合物（MRE11-RAD50-NBS1）識(shí)別，并在損傷部位將絲氨酸139（S139）磷酸化H2AX為γH2AX。隨后γH2AX通過(guò)招募更多MRN復(fù)合物來(lái)募集DNA修復(fù)組分如53BP1等，有助于維持DDR信號(hào)的穩(wěn)定。激活A(yù)TM的主要底物為CHK2，CHK2通過(guò)自身磷酸化和磷酸化MDM2來(lái)激活和穩(wěn)定抑癌基因p53。ATR主要由DNA SSB激活，激活機(jī)制為復(fù)制蛋白A（RPA）識(shí)別并結(jié)合已經(jīng)形成的DNA SSB，ATR則通過(guò)其專性結(jié)合配偶體ATR-相互作用蛋白（ATRIP）募集到RPA-ssDNA復(fù)合物上，同時(shí)募集Rad9-Rad1-Hus1（9-1-1）及其復(fù)合的拓?fù)洚悩?gòu)酶結(jié)合配偶體1（TOPBP1）共同參與。ATR磷酸化最主要的底物為CHK1，ATR/CHK1途徑在S期以及G2/M期細(xì)胞周期檢查點(diǎn)中起重要作用。ATM是一種公認(rèn)的抑癌基因，由于腫瘤發(fā)生的早期階段常伴有復(fù)制應(yīng)激或端粒縮短等過(guò)程從而激活DDR途徑，因此ATM被激活所引起的細(xì)胞周期停滯可能成為腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素[17]。

圖2 ATM、ATR、CHK1、CHK2在DDR中的作用及相關(guān)信號(hào)通路

2.2 ATM抑制劑治療卵巢癌的研究進(jìn)展 在治療中發(fā)現(xiàn)ATM突變患者對(duì)放療和化療的敏感性差，以及臨床前試驗(yàn)證明ATM抑制劑是放療的強(qiáng)效增敏劑，為ATM抑制劑的開發(fā)提供了理論依據(jù)[18]。除單藥抗瘤作用外，其與免疫抑制劑及DNA-PK的聯(lián)合也為其臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。AZD0516是臨床上第一個(gè)開發(fā)研制的ATM抑制劑，具有高效、口服吸收好以及選擇性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，具有較長(zhǎng)的血漿半衰期。前期臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明AZD0516能夠在小鼠異種移植模型中增強(qiáng)伊立替康和奧拉帕尼等DNA DSB誘導(dǎo)劑的功效，目前該藥物的Ⅰ期臨床試驗(yàn)（NCT02588105）正在進(jìn)行中，期待其與奧拉帕尼聯(lián)合應(yīng)用于晚期卵巢癌的靶向治療[19]。

3 ATR抑制劑

3.1 ATR抑制劑的作用機(jī)制 ATR是增殖細(xì)胞中必不可少的結(jié)構(gòu)，主要負(fù)責(zé)識(shí)別DNA損傷并限制損傷DNA檢查點(diǎn)激活以阻止受損細(xì)胞增殖。ATR主要由SSB激活，激活后通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)阻止G2期細(xì)胞增殖。ATR抑制劑在腫瘤細(xì)胞中可導(dǎo)致細(xì)胞毒性的損傷及有絲分裂突變的積累，而對(duì)正常細(xì)胞的G1檢查點(diǎn)無(wú)影響[20]。此外，由于癌細(xì)胞的復(fù)制應(yīng)激水平遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞，ATR具有穩(wěn)定復(fù)制應(yīng)激的作用，因此ATR抑制劑可以增強(qiáng)復(fù)制應(yīng)激對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力。

3.2 ATR抑制劑的研究進(jìn)展 五味子乙素B、NU6027、NVP-BEZ235等為早期的ATR抑制劑，但由于其特異性差限制了其臨床應(yīng)用。VE-822（VX970）是第一個(gè)進(jìn)入臨床開發(fā)的ATR抑制劑，其單藥治療無(wú)效，聯(lián)合治療卵巢癌的療效正在評(píng)估中。進(jìn)行中的Ⅱ期臨床試驗(yàn)（NCT02595892）評(píng)估吉西他濱單藥及聯(lián)合VE-822治療鉑類耐藥的復(fù)發(fā)性卵巢癌患者的療效，正在進(jìn)行的Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗(yàn)（NCT02627443）則評(píng)估吉西他濱、卡鉑和VE-822在攜帶gBRCAm鉑類化療敏感的卵巢癌患者中的療效[21]。AZD6738是臨床開發(fā)的第2種ATR抑制劑，具有更好的溶解度、生物利用度和藥代動(dòng)力學(xué)特性，這些特性也使其更適合口服。AZD6738單藥及與奧拉帕尼或放療聯(lián)合治療卵巢癌在小鼠模型中均顯示有效[22]。一項(xiàng)評(píng)估AZD6738與奧拉帕尼聯(lián)合治療難治性卵巢癌患者的臨床試驗(yàn)（NCT03462342）正在進(jìn)行中。

4 CHK抑制劑

4.1 CHK1、CHK2抑制劑的作用機(jī)制 CHK1是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，與CHK2一起在維持DNA完整性方面具有重要作用。CHK1是ATR下游的主要效應(yīng)器，主要在絲氨酸317及絲氨酸345上被ATR磷酸化，激活的CHK1會(huì)觸發(fā)S期和G2/M期檢查點(diǎn)。CHK1對(duì)于細(xì)胞周期的調(diào)控和復(fù)制壓力的響應(yīng)以及維持基因組的完整性至關(guān)重要[23]。CHK2也是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是ATM下游的主要效應(yīng)器。在DDR中，CHK2起到DSB的修復(fù)和修飾、調(diào)節(jié)S期和G2/M細(xì)胞周期停滯以及不可修復(fù)時(shí)引發(fā)細(xì)胞凋亡的作用[24]。CHK抑制劑通過(guò)抑制上述途徑起到調(diào)控細(xì)胞周期治療卵巢癌的作用。

4.2 CHK1、CHK2抑制劑治療卵巢癌的研究進(jìn)展已發(fā)現(xiàn)具有廣譜功效的CHK1抑制劑包括UCN-01、XL844和CBP501，然而由于其缺乏特異性、半衰期長(zhǎng)等缺陷限制了其臨床應(yīng)用[23]。隨后開發(fā)的特異性ATP競(jìng)爭(zhēng)性CHK1/2抑制劑AZD7762顯示具有克服卵巢透明癌細(xì)胞系的順鉑耐藥性作用，但是由于后期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的心肌毒性和不良反應(yīng)嚴(yán)重限制了其臨床開發(fā)[25]。Prexasertib（LY2603618）是第一種有效的選擇性CHK1/2抑制劑，降低心肌毒性的同時(shí)改善了藥代動(dòng)力學(xué)特征[26]。在小鼠腫瘤移植模型中，Prexasertib已經(jīng)顯示單藥治療有效性并且能夠增加鉑類和奧拉帕尼的治療敏感性[27]。已結(jié)束的Ⅱ期臨床試驗(yàn)（NCT02203513）招募了28例BRCA野生型高級(jí)別漿液性卵巢癌患者，評(píng)估靜脈注射Prexasertib的療效。24例可評(píng)估患者中有19例出現(xiàn)細(xì)胞周期素E（cyclin E）的上調(diào)、CCEN1的擴(kuò)增或蛋白過(guò)表達(dá)，使其對(duì)正常細(xì)胞周期破壞更加敏感，從而識(shí)別和修復(fù)DNA損傷；19例鉑類耐藥性卵巢癌患者中有11例（58%）受益于Prexasertib的治療[28]。此外，正在進(jìn)行的2項(xiàng)臨床試驗(yàn)（NCT02203513，NCT 03414047）旨在分別評(píng)估Prexasertib單藥治療高級(jí)別漿液性卵巢癌和鉑類耐藥性復(fù)發(fā)性卵巢癌的療效。

5 結(jié)語(yǔ)和展望

本文綜述了 PARP、ATM、ATR、CHK1、CHK2 共5種DDR通路相關(guān)蛋白激酶抑制劑的作用機(jī)制及其治療卵巢癌的最新研究進(jìn)展。除此之外，DNA-PK、WEE1等其他DDR通路相關(guān)蛋白激酶的臨床試驗(yàn)也在開展中，有作為DNA損傷修復(fù)靶標(biāo)用于治療卵巢癌的潛力。然而，目前針對(duì)DDR通路相關(guān)抑制劑的研發(fā)還存在以下幾方面問(wèn)題：首先是需要確定更多DDR抑制劑敏感的預(yù)測(cè)性生物學(xué)標(biāo)志物，并且僅僅預(yù)測(cè)單藥治療的生物學(xué)標(biāo)志物還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，還要更多關(guān)注聯(lián)合療法的預(yù)測(cè)性生物學(xué)標(biāo)志物?，F(xiàn)有包括BRCA基因作為PARP抑制劑的生物學(xué)標(biāo)志物已經(jīng)用于臨床治療，臨床前試驗(yàn)表明ATR抑制劑對(duì)ATM缺失、ARID1A突變敏感等。其次是如何解決細(xì)胞對(duì)DDR抑制劑的耐藥性問(wèn)題，以及能否結(jié)合對(duì)已應(yīng)用于臨床的PARP抑制劑的了解來(lái)預(yù)測(cè)哪種機(jī)制對(duì)其他DDR抑制劑產(chǎn)生抗性。例如腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)在BRCA1/2等位基因中產(chǎn)生體細(xì)胞逆轉(zhuǎn)從而修復(fù)HR，以及通過(guò)尋找保護(hù)復(fù)制叉的替代機(jī)制從而避免PARP抑制劑的毒性殺傷作用。此外，不同類型DDR抑制劑之間及其與放化療以及免疫抑制劑的聯(lián)合治療也具有廣泛研究前景，例如DDR抑制劑和免疫抑制劑抗癌機(jī)制不同，聯(lián)合應(yīng)用可減少耐藥性產(chǎn)生。但是首次臨床嘗試的聯(lián)合化療會(huì)造成劑量限制的骨髓抑制等毒副作用，如何減輕副作用成為臨床研發(fā)的關(guān)鍵。

目前針對(duì)卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案也在不斷改進(jìn)，包括減瘤手術(shù)技術(shù)的完善、設(shè)備的更新、“最佳減瘤法”定義的不斷改進(jìn)爭(zhēng)取完全切除病灶以及鉑類/紫杉醇等化療方案的個(gè)體化。除完善標(biāo)準(zhǔn)治療方案外，聯(lián)合應(yīng)用新型靶向治療藥物也為卵巢癌患者提供了多樣化治療方案，其中DDR通路相關(guān)抑制劑是最具潛力的靶向藥物。新型DDR抑制劑的開發(fā)需要借鑒奧拉帕尼等已應(yīng)用于臨床的DDR抑制劑的經(jīng)驗(yàn)。隨著對(duì)不同病理類型卵巢癌分子表型研究的深入，新的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)方向可以基于這些新發(fā)現(xiàn)的腫瘤表型和基因型的基礎(chǔ)上開展，如CCEN1的上調(diào)和過(guò)表達(dá)與基因組不穩(wěn)定有關(guān)等，而不局限于針對(duì)BRCA基因的大型臨床研究。