梯棱羊肚菌菌絲培養(yǎng)條件

李巖龍

（1.甘肅省白龍江林業(yè)管理局林業(yè)科學(xué)研究所，甘肅 隴南 746010；2.甘肅白龍江森林生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家定位觀測(cè)研究站，甘肅 舟曲 746300）

羊肚菌為子囊菌亞門(mén)盤(pán)菌綱羊肚菌科羊肚菌屬真菌的總稱[1]，主要分布于北半球，是世界上最受歡迎的食用菌之一，在我國(guó)主要分布在云南、四川、陜西、甘肅、青海、西藏、新疆、山西、內(nèi)蒙古、遼寧等地，因菌蓋部分凹凸成蜂窩狀，形狀酷似翻開(kāi)的羊肚（胃）而得名。羊肚菌不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，味美可口，而且是一種重要的藥用真菌，主治精腎虧損，對(duì)頭暈失眠、腸胃炎癥等有良好的治療作用[2]，但價(jià)格昂貴，而野生資源又遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要，羊肚菌的人工馴化栽培一直是羊肚菌研究的熱點(diǎn)之一。為了篩選適合當(dāng)?shù)氐脑耘喾N，我們引進(jìn)了梯棱羊肚菌Morchella importuna 菌株，研究培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、酸堿度、碳源和氮源等條件要求，旨在為羊肚菌的人工種植提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

供試菌種梯楞羊肚菌M6613 菌株由中國(guó)科學(xué)院昆明植物所提供。

1.2 培養(yǎng)基

試驗(yàn)共采用7 種培養(yǎng)基，除培養(yǎng)基I 為PDA培養(yǎng)基外，其他6 種均為復(fù)合培養(yǎng)基。

PDA 培養(yǎng)基（I）：馬鈴薯200 g 洗凈去皮切成小塊，加水煮爛，用八層紗布過(guò)濾取過(guò)濾液（下同）；過(guò)濾液，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，加熱攪拌混勻，稍冷卻后加蒸餾水至1 000 ml，pH 值6.5，分裝試管或者錐形瓶，加塞、包扎，121 ℃滅菌20 min（下同）；

PDA 麩皮培養(yǎng)基（II）：馬鈴薯過(guò)濾液，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，麩皮浸泡液60 ml，加熱攪拌混勻，稍冷卻后加蒸餾水至1 000 ml，pH 值6.5；

PDA 玉米培養(yǎng)基（III）：馬鈴薯過(guò)濾液，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，玉米粉浸泡液60 ml，加熱攪拌混勻，稍冷卻后加蒸餾水至1 000 ml，pH 值6.5；

PDA 土壤培養(yǎng)基（IV）：馬鈴薯過(guò)濾液，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，土壤浸泡液60 ml，加熱攪拌混勻，稍冷卻后加蒸餾水至1 000 ml，pH 值6.5；

PDA 綜合培養(yǎng)基（V）：馬鈴薯過(guò)濾液，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1g，VB150 μg，瓊脂15 g，加熱攪拌混勻，稍冷卻后加蒸餾水至1 000 ml，pH 值6.5；

MYG 培養(yǎng)基（VI）：麥芽浸膏5 g，酵母膏4 g，葡萄糖10 g，淀粉15 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂15 g，加熱攪拌混勻，稍冷卻后加蒸餾水至1 000 ml，pH 值6.5；

基礎(chǔ)培養(yǎng)基（VII）：葡萄糖12 g，KNO31.85 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.1 g，F(xiàn)eCl30.01 g，VB1 100 μg，瓊脂20 g，加熱攪拌混勻，稍冷卻后加蒸餾水至1 000 ml，pH 值6.5。

1.3 菌種制備

將活化后的菌株的純培養(yǎng)物分別接種于PDA平板中央，于20±1 ℃恒溫條件下暗培養(yǎng)2～3 d，當(dāng)菌絲生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿邊緣時(shí)進(jìn)行接種。

1.4 試驗(yàn)方法

采用平板培養(yǎng)法，通過(guò)測(cè)定不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)基中菌絲的生長(zhǎng)速度、菌絲生長(zhǎng)勢(shì)和菌核情況來(lái)考察供試條件對(duì)菌絲和菌核生長(zhǎng)的影響。試驗(yàn)均采用9 cm 培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基用量為每皿20 ml，培養(yǎng)皿中央定量接種8 mm 的菌餅1 塊，在(20±1)℃，相對(duì)濕度70%～75%下暗培養(yǎng)，試驗(yàn)均設(shè)置5個(gè)重復(fù)。采用劃線法每隔8 h 測(cè)1 次菌落直徑，共培養(yǎng)2～3 d，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速率。

1.5 溫度和酸堿度

溫度：選用PDA 培養(yǎng)基，將菌種塊接種于PDA 培養(yǎng)基平板中央，然后分別放置于5、10、15、20、25、30、35 ℃等7個(gè)不同溫度處理下恒溫培養(yǎng)，每隔8 h 觀測(cè)1 次，記錄菌絲生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)勢(shì)和菌核情況。

酸堿度試驗(yàn)：配制PDA 培養(yǎng)基并滅菌，在無(wú)菌條件下用滅菌的0.2 mol/L 的NaOH 溶液和0.2 mol/L 的HCl 溶液調(diào)節(jié)的酸堿度，試驗(yàn)設(shè)置pH 值5.0、5.5、6.0，6.5、7.0、7.5、8.0 等7 個(gè)酸堿度處理。

1.6 碳源和氮源

碳源試驗(yàn)：以基礎(chǔ)培養(yǎng)基中12 g 葡萄糖的含碳量為標(biāo)準(zhǔn)，分別以相等含碳量的蔗糖（10.4 g），麥芽糖（10.9 g），可溶性淀粉（9.8 g），甘油（8.4 g），甘露醇（11.0 g），代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖；氮源試驗(yàn)：以基礎(chǔ)培養(yǎng)基中1.85 g KNO3的含氮量為標(biāo)準(zhǔn)，分別以相等含氮量的尿素（1.53 g），蛋白胨（5.71 g），(NH4)2SO4（3.37 g），NH4NO3（2.04 g），NaNO4（4.34 g）代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的KNO3，其他成分同基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基的影響

供試菌株在各種復(fù)合培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)并產(chǎn)生菌核，其中，菌絲在PDA 綜合培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最快，生長(zhǎng)速度達(dá)到15.69 mm/d，生長(zhǎng)勢(shì)也很好，其次是PDA 土壤培養(yǎng)基，生長(zhǎng)速度為14.47 mm/d，其他幾種復(fù)合培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度相差不大，均在13.22～13.99 mm/d 之間；最適合菌核形成的培養(yǎng)基是PDA 麩皮培養(yǎng)基。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)生長(zhǎng)的影響

2.2 不同溫度的影響

不同溫度對(duì)菌株菌絲的生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)勢(shì)及產(chǎn)核等有著明顯的影響（表2）。菌絲在5～30 ℃下均能生長(zhǎng)，35 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)被抑制，菌核在5～25 ℃的溫度范圍內(nèi)就能形成，30 ℃和35 ℃時(shí)供試菌株不形成菌核，25 ℃時(shí)形成菌核的數(shù)量明顯少于5 ℃和10 ℃，表明菌核形成的溫度范圍窄于菌絲生長(zhǎng)的溫度范圍，相對(duì)于菌絲生長(zhǎng)，低溫更有利于菌核的形成；在試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)，20 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)的速度最快，長(zhǎng)勢(shì)最好，形成的菌核也最多，因此，20 ℃是供試菌株菌絲生長(zhǎng)和菌核形成的最適溫度。

表2 不同溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)菌株生長(zhǎng)和菌核形成的影響

2.3 不同酸堿度的影響

在pH 值5～8 的條件下，供試羊肚菌的菌絲均可生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度隨酸堿度的變化呈單峰狀，峰值出現(xiàn)在pH 值6.5，即pH 值6.5 是該菌種菌絲生長(zhǎng)的最適酸堿度；菌絲生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)勢(shì)和菌核形成的數(shù)量在pH 值6～7 范圍內(nèi)明顯好于其他pH 值，說(shuō)明該菌株適宜在弱酸性的環(huán)境中生長(zhǎng)。

表3 不同PH 值對(duì)菌株生長(zhǎng)和菌核形成的影響

2.4 不同碳源的影響

菌絲在不同碳源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，且都能產(chǎn)生菌核，其中，在氮源為蔗糖和葡萄糖的培養(yǎng)基生長(zhǎng)速度最快，分別為13.29 mm/d 和13.14 mm/d，生長(zhǎng)勢(shì)也最好，形成菌核較多，氮源為甘露醇時(shí)菌絲生長(zhǎng)緩慢且長(zhǎng)勢(shì)較差（表4），表明該菌株菌絲生長(zhǎng)和菌核形成的最適氮源是蔗糖和葡萄糖，菌株對(duì)甘露醇利用效果較差。

表4 不同碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)和菌核形成的影響

2.5 不同氮源的影響

供試菌株能利用多種氮源，但不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)和菌核的形成影響很大，菌絲在KNO3和NaNO3為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最快，KNO3為氮源時(shí)的菌絲生長(zhǎng)勢(shì)明顯好于NaNO3，尿素為氮源的培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)最慢，(NH4)2SO4和NH4NO3等銨鹽為氮源時(shí)菌絲生長(zhǎng)緩慢，說(shuō)明菌絲生長(zhǎng)的最適的氮源是KNO3，尿素對(duì)菌絲生長(zhǎng)有抑制作用，銨鹽對(duì)菌絲生長(zhǎng)也有一定的影響，該菌株不能很好地利用銨鹽；菌核在以KNO3和蛋白胨為氮源是形成的最多，以(NH4)2SO4和NH4NO3等銨鹽為氮源不形成菌核。

表5 不同氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)和菌核形成的影響

3 結(jié)論與討論

7 種復(fù)合培養(yǎng)基中梯棱羊肚菌M6613 菌株的菌絲均能正常生長(zhǎng)且都能形成菌核，最適菌絲生長(zhǎng)的復(fù)合培養(yǎng)基為PDA 綜合培養(yǎng)基和PDA 土壤培養(yǎng)基，最適菌核形成的復(fù)合培養(yǎng)基為PDA 麩皮培養(yǎng)基；M6613 菌株菌絲生長(zhǎng)和菌核形成的最適溫度20 ℃，最適酸堿度為pH 值6.5；最適菌絲生長(zhǎng)和菌核形成的碳源為蔗糖和葡萄糖，尿素對(duì)菌絲的生長(zhǎng)有抑制作用，(NH4)2SO4和NaNO4等銨鹽存在時(shí)，菌絲生長(zhǎng)緩慢；最適菌絲生長(zhǎng)的氮源為KNO3，最適菌核形成的氮源為KNO3和蛋白胨，氮源為(NH4)2SO4和NaNO3等銨鹽時(shí)，不形成菌核。

供試菌株在5～20 ℃的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的上升，菌絲生長(zhǎng)勢(shì)越來(lái)越好，長(zhǎng)速越來(lái)越快，溫度超過(guò)20 ℃時(shí)，隨著溫度上升，菌絲生長(zhǎng)減慢，35 ℃時(shí)，菌絲停止生長(zhǎng)，20 ℃是菌絲生長(zhǎng)的最適溫度，這和陳芳草等[3]和朱斗錫等[4]結(jié)果大致相同，與秦曉波等[5]，薛迎迎等[6]（最適溫度為25 ℃）和江潔等[7]（最適溫度為28 ℃）結(jié)果不一致。大致來(lái)說(shuō)，18～25 ℃是比較適宜的菌絲生長(zhǎng)溫度，低于2 ℃或高于34.5 ℃，菌絲生長(zhǎng)受到抑制[8]。供試菌株在15～20 ℃是容易形成菌核，且形成菌核的數(shù)量最多，與劉興蓉等[9]研究結(jié)果一致，與謝方等[10]（最適溫度為20～30 ℃）的結(jié)論不符，可能與選用的中溫菌株有關(guān)。溫度是影響羊肚菌菌絲生長(zhǎng)的主導(dǎo)因素[11]，不同研究者在不同的羊肚菌菌種或菌株試驗(yàn)中得出適宜溫度并不相同，可能是不同菌種或菌株對(duì)溫度的耐受性不同，也可能是在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中對(duì)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境的適應(yīng)[10]。

碳源和氮源對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)和菌核的形成有重要的作用[12]，本實(shí)驗(yàn)中蔗糖、葡萄糖是最適合菌絲生長(zhǎng)的碳源，與大多是研究結(jié)論一致[8,13]，KNO3和NaNO3是較好的氮源，但是銨鹽對(duì)菌絲生長(zhǎng)有影響，生長(zhǎng)速度明顯降低，抑制菌核形成，尿素對(duì)生長(zhǎng)的作用很差，這與董雪[14]硝酸KNO3和NaNO3是羊肚菌生長(zhǎng)較好氮源，尿素、(NH4)2SO4和NH4NO3作用效果較差的結(jié)論一致，也和李青[15]尿素作用效果差和朱永真等[16]認(rèn)為羊肚菌對(duì)銨根離子利用效果差的結(jié)論一致，但與刁治明等[17]和任佳梅等[18]研究結(jié)果不同，他們認(rèn)為尿素是羊肚菌菌絲生長(zhǎng)的最優(yōu)氮源，各個(gè)研究者在最佳氮源和碳源的研究中得出的結(jié)論差異很大，可能與羊肚菌不同種類及其菌株對(duì)營(yíng)養(yǎng)的利用不用，也可能與羊肚菌的產(chǎn)地有關(guān)，不同的生長(zhǎng)環(huán)境導(dǎo)致其對(duì)營(yíng)養(yǎng)的利用不同[15]。

羊肚菌不同菌株的生物學(xué)特性差異較很大[10,19]，這種差異是不同菌種或菌種本身遺傳多樣性所致，還是種類或菌株對(duì)不同生長(zhǎng)環(huán)境的適應(yīng)，還需進(jìn)一步研究確定，從而為培育羊肚菌人工栽培的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的菌種提供依據(jù)。