高含量豬去氧膽酸精制工藝的研究

徐賓朋，郭慶，趙露，趙厚發(fā)

（安徽科寶生物工程有限公司，安徽 淮北 235025）

豬去氧膽酸（Hyodesoxycholic Acid，HDCA）是豬膽汁的主要成分，具有降血脂、鎮(zhèn)痙、祛痰作用，臨床上用于高血脂癥、氣管炎以及由肝膽疾病引起的消化不良，其作為清開(kāi)靈注射劑中的有效成分，經(jīng)臨床觀察對(duì)急性白血病的治療有良好作用，體外實(shí)驗(yàn)證明其具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞的增殖分裂作用，也是人工牛黃的重要原料[1-2]，同時(shí)也是半合成鵝去氧膽酸和熊去氧膽酸的原料。

豬去氧膽酸的精制有如下方法，重結(jié)晶法；將豬去氧膽酸采用乙酸乙酯進(jìn)行2次重結(jié)晶，得到高含量的豬去氧膽酸，但產(chǎn)品的收率將會(huì)大大降低[3]。甲酯化法；將HDCA轉(zhuǎn)化為豬去氧膽酸甲酯-苯加成物后堿分解，調(diào)節(jié)pH、沉淀、得HDCA純品；鎂鹽法：將粗HDCA轉(zhuǎn)化為粗豬去氧膽酸鎂后，酸化、結(jié)晶，得HDCA純品，上述2種方法均需要將HDCA進(jìn)行化學(xué)預(yù)處理，工藝步驟繁瑣，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，其中使用的苯為致癌物質(zhì)[4-6]。針對(duì)現(xiàn)有的高含量豬去氧膽酸精制中存在的問(wèn)題。

本研究采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)選出最佳除雜工藝條件且進(jìn)行了驗(yàn)證；對(duì)乙酯量、活性炭量及回流時(shí)間為考察因素對(duì)精制工藝進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,并對(duì)優(yōu)選的精制工藝進(jìn)行驗(yàn)證。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

豬去氧膽酸對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，豬去氧膽酸粗品購(gòu)自四川某生物公司。

1.2 儀器及試劑

ZL-2000磁力攪拌加熱套、R1001N型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；水浴鍋、SHZ-5B型真空泵電熱鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)自鞏義市予華儀器有限公司；TP-2000電子天平購(gòu)自福州華志科學(xué)儀器有限公司；8205A型筆試pH 計(jì)購(gòu)自上?？祪x儀器有限公司；SHT型攪拌數(shù)顯恒溫電熱套購(gòu)自山東鄄城華魯電熱儀器有限公司；Waters-1525型高效0液相色譜儀、Waters-2424型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)沃特世科技有限公司)。氫氧化鈉、濃鹽酸、冰醋酸、乙酸乙酯購(gòu)自濱化集團(tuán)股份有限公司，工業(yè)級(jí)。

2 方法

2.1 工業(yè)步驟

稱取豬去氧膽酸粗品，加水和氫氧化鈉，加熱至80℃，使其完全溶解，降溫至50℃，加入澄清劑，繼續(xù)加熱至90℃，保溫反應(yīng)30 min，降至常溫，過(guò)濾，收集濾液，調(diào)pH 2～3，得濕品豬去氧膽酸；將濕品豬去氧膽酸稱重，加入乙酸乙酯，攪拌使其溶解后，加活性炭，加熱回流，趁熱精密過(guò)濾器過(guò)濾，濃縮乙酯層至出現(xiàn)白色顆粒狀結(jié)晶，停止?jié)饪s，降溫冷卻結(jié)晶，離心的高含量豬去氧膽酸濕品，60℃干燥2 h，80℃干燥2 h，稱重得高含量豬去氧膽酸成品。

2.2 主要檢測(cè)指標(biāo)

2.2.1 熔點(diǎn)的檢測(cè)方法

按照參考文獻(xiàn)[1]的方法進(jìn)行檢測(cè)。

2.1.2 比旋度的檢測(cè)方法

按照參考文獻(xiàn)[1]的方法進(jìn)行檢測(cè)。

2.1.3 醇溶度的檢測(cè)方法

按照參考文獻(xiàn)[1]的方法進(jìn)行檢測(cè)。

2.1.4 殘?jiān)臋z測(cè)方法

按照參考文獻(xiàn)[1]的方法進(jìn)行檢測(cè)。

2.1.5 含量的檢測(cè)方法

測(cè)定粗品和精品豬去氧膽酸的含量,依據(jù)參考文獻(xiàn)采用高效液相色譜法，采用C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇∶乙腈∶冰醋酸(0.5%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))溶液(49∶20∶31)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為25℃，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，漂移管溫度為108℃，載氣流速為2.8 L·min-1。

3 結(jié)果與分析

3.1 豬去氧膽酸除雜工藝的優(yōu)化

3.1.1 制定因素水平表根據(jù)文獻(xiàn)[8]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,考察的因素及其范圍確定如下:水用量的倍數(shù)、pH、澄清劑的量,選L9(34)的正交設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平,因素水平見(jiàn)表1。

表1 除雜工藝因素水平表

3.1.2 試驗(yàn)方法

稱取CK191202批次豬去氧膽酸粗品100 g，按設(shè)計(jì)條件加水溶解，調(diào)pH溶解后，60℃加入澄清劑，85℃保溫反應(yīng)30 min，降至常溫過(guò)濾，濾液用稀鹽酸酸化至pH4.0，豬去氧膽酸析出，離心，干燥得豬去氧膽酸，按2.2法檢測(cè)主要指標(biāo)。

3.1.3 除雜工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析

經(jīng)SPSS18.0統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

方差分析因素的主次關(guān)系為A＞B＞C,其中A2＞A3＞A1,B1＞B2＞B3,C2＞C3＞C1,最佳的方案為A2B2C3。方差分析結(jié)果表明：A因素的影響具有顯著意義(P＜0.05),B、C因素對(duì)收率的影響均不顯著(P＞0.05)。

3.1.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

從表2和表3實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，最佳方案為A2B2C3，為驗(yàn)證上述工藝的正確性，做A2B2C3工藝驗(yàn)證試驗(yàn)。

表2 除雜工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 除雜工藝方差分析表

用不同批次的5批豬去氧膽酸粗品各稱取100 g，按工藝A2B2C3做驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得豬去氧膽酸粗品得量和含量，計(jì)算收率,得出不同批次不同含量的原料，通過(guò)優(yōu)化的除雜工藝，收率和醇溶度均合格，說(shuō)明除雜工藝的最佳工藝條件為A2B2C3，即10倍量的水，pH 11.5,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的澄清劑，可以滿足不同的原料的除雜。驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同批次的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2 豬去氧膽酸精制工藝的優(yōu)化

3.2.1 粗品制備

稱取CK191210批豬去氧膽酸2 kg，加20 kg的水，調(diào)pH 11.5，加熱至60℃，加30 g澄清劑（溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的冰醋酸），保溫反應(yīng)30 min，降溫至常溫，過(guò)濾，濾液用稀鹽酸酸化至pH 4,抽濾，干燥得豬去氧膽酸粗品1 632 g,得率81.6%,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.5%，收率97.4%。

3.2.2 制備因素水平表

根據(jù)文獻(xiàn)[8]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,考察的因素及其范圍確定如下:乙酸乙酯量、活性炭用量和回流時(shí)間，選L9(34)的正交設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平,因素水平見(jiàn)表5。

表5 精制工藝正交因素水平表

3.2.3 精制工藝

稱取豬去氧膽酸粗品100 g，分別按照L9(34)表中設(shè)計(jì)的條件進(jìn)行精制，加乙酸乙酯，活性炭，加熱回流，精密過(guò)濾器去除活性炭，濾液濃縮至出現(xiàn)白色顆粒結(jié)晶時(shí)，停止?jié)饪s，取出降溫冷卻結(jié)晶，抽濾結(jié)晶，濾液再次濃縮結(jié)晶，合并結(jié)晶，干燥，取樣檢測(cè)豬去氧膽酸的含量和殘?jiān)?/p>

3.2.4 精制工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析

計(jì)算結(jié)果及方差分析結(jié)果見(jiàn)表6和表7。

表6 精制工藝正交的試驗(yàn)結(jié)果

表7 精制的方差分析表

從表6和表7中可以看出，三種因素的影響程度依次為：A＞B＞C。其中A3＞A2＞A1,B2＞B3＞B1,C1＞C2＞C3，A因素的影響具有顯著的意義(P＜0.05)，B、C因素對(duì)收率的影響均不顯著(P＞0.05)。最佳的精制工藝條件為A3B2C1，即12倍量的乙酸乙酯、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的活性炭，加熱回流1 h。

3.2.5 工藝驗(yàn)證

選擇除雜工藝中的相對(duì)應(yīng)的5批粗品，進(jìn)行工藝驗(yàn)證，按照最佳工藝條件即12倍量的乙酸乙酯、3%的活性炭，加熱回流1 h。結(jié)果與正交實(shí)驗(yàn)中收率最高的序列8吻合，說(shuō)明了該最佳工藝條件，針對(duì)不同含量的粗品均可達(dá)到高含量和高收率，從而證明該最佳精制工藝的穩(wěn)定性和合理性。結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 精制最佳工藝的驗(yàn)證結(jié)果

4 結(jié) 論

最佳除雜工藝為水量是10倍量、pH 11～12，澄清劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%；最佳的精制為工藝乙酸乙酯用量為12倍量、活性炭的用量為3%，回流時(shí)間1 h。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)本精制工藝對(duì)原料的選擇，控制在低含量的豬去氧膽酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于75%且殘?jiān)淮笥?%，為高含量豬去氧膽酸精制的最低標(biāo)準(zhǔn)。一般粉末的活性炭不能滿足吸附脫色的效果，必選選擇醫(yī)用767的活性炭，且使用前需105℃活化4 h。