基于熒光素的TPA型Cu+反應(yīng)探針研究

陳孝云,鄧 鑫, 湯耀南, 袁夢婭,袁書俠

(江蘇科技大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,鎮(zhèn)江 212003)

眾所周知,銅是人體中含量前三的過渡金屬元素,是生物體內(nèi)不可或缺的微量元素之一[1].銅元素的變價屬性,使得它能作為蛋白質(zhì)中的催化和結(jié)構(gòu)輔助因子，并參與到生命體的呼吸、代謝、細(xì)胞生長和分化、氧運(yùn)輸以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等各種基本生命過程[2-4]．因此,攝入適量的銅并保持銅在生物體中微妙的平衡，對生物體的正常運(yùn)行有著極其重要的作用．研究表明,生物體攝入過量的銅或銅缺乏(統(tǒng)稱銅失調(diào))會引起一系列的疾病,如阿爾茨海默氏癥、亨廷頓氏癥和帕金森癥等神經(jīng)退行性疾病[5-8]，Menkes疾病與Wilson等遺傳性疾病[6,9-10]，以及糖尿病和肥胖等代謝紊亂性疾病等[11-12]．生物體一般從食物中補(bǔ)充的為Cu2+,因此在進(jìn)入腸道后要先被還原成Cu+才能完成后續(xù)的吸收、運(yùn)輸?shù)裙ぷ鱗13]．研究銅在生物體內(nèi)的作用,主要需要研究生物體內(nèi)的Cu+在某些特定生命過程的行為．因此,如何實現(xiàn)Cu+在某一代謝過程的可視化追蹤尤為重要．如果能夠?qū)崿F(xiàn)Cu+在特定區(qū)域內(nèi)可視化實時原位檢測,對于明確其生物作用很有幫助．隨著小分子探針研究工作的不斷發(fā)展,越來越多的小分子探針被成功應(yīng)用于活體內(nèi)各種金屬離子的可視化檢測[14-18].一系列性能優(yōu)異的Cu+熒光探針應(yīng)運(yùn)而生,如基于肽鏈的Cu+熒光探針[18-20]、以含N和S的冠醚及其類似結(jié)構(gòu)為Cu+接受基團(tuán)的探針[21-27]和以三(2-吡啶甲基)胺(TPA)為接受基團(tuán)的Cu+的選擇性熒光探針[28-31]等．2010年，文獻(xiàn)[32]報道了一類性能優(yōu)異的基于熒光素的TPA類Cu+熒光探針FluTPA(圖1)．該探針具有良好的膜透性,可以很好地穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),并能在細(xì)胞內(nèi)的水溶液中很好地分散．此外,該探針是一個反應(yīng)性探針:首先TPA與還原形式的熒光素母環(huán)通過芐醚鍵連接起來,此時整個探針分子呈現(xiàn)熒光淬滅．但當(dāng)該探針分子遇到Cu+后，TPA首先與Cu+絡(luò)合,通過進(jìn)一步氧化還原反應(yīng)使得芐醚鍵斷裂，生成相應(yīng)的熒光素而呈現(xiàn)極強(qiáng)的熒光性質(zhì)(圖2)．

圖1 Cu+選擇性熒光探針(FluTPA)Fig.1 Selective fluorescent probe of Cu+(FluTPA)

圖2 FluTPA類探針的工作原理Fig.2 Principle of FluTPA sensors

此類反應(yīng)性探針分子對Cu+具有極好的選擇性,可以消除一般探針分子的高背景熒光的共性問題[28, 31]．熒光素及具有類似結(jié)構(gòu)的羅丹明是極常見的一類染料，不僅具有好的膜透性和水溶性,而且還有很高的熒光量子產(chǎn)率、較長激發(fā)波長和發(fā)射波長等優(yōu)點．因此,如能基于文獻(xiàn)[32]的工作,設(shè)計并合成出性能更好的類似熒光探針,對檢測活體內(nèi)Cu+大有裨益．目前,仍需對以下幾個問題進(jìn)行進(jìn)一步研究:(1) 合成難度較大,特別是后處理較難．需找到合適的路線合成出一系列9-Ar取代的熒光素類TPA型Cu+選擇性探針.(2) 熒光素環(huán)上的9號位取代芳環(huán)上的取代基類型及位置對該類探針性質(zhì)的影響.理論上來講,當(dāng)9號位的取代基與熒光素間的共軛作用越大且共軛區(qū)域內(nèi)的電子云密度較大時,熒光針的熒光強(qiáng)度會增強(qiáng),所需的激發(fā)波長也越靠近紅外光．此類探針與Cu+絡(luò)合后會發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而使得芐醚鍵斷裂，生成有強(qiáng)熒光的熒光酮．但是,探針分子共軛區(qū)域內(nèi)的電子云密度越大,芐醚鍵越不容易斷裂．鑒于上述原因,文中設(shè)計并合成了共軛面更大的9-Ph取代的探針分子4(FluTPA’-1)和具有更大電子云密度的9-(2-MeOPh)探針分子13(FluTPA’-2)兩種類似探針分子,測定了其基本性質(zhì)．FluTPA’-1的合成路線見式(1)[32-34]，F(xiàn)luTPA’-2的合成路線見式(2)[35-38]，TPA-Cl的制備路線見式(3)[39-41]．

1 實驗

1.1 儀器與試劑

美國安捷倫公司的傅立葉變換紅外光譜儀;美國安捷倫公司Agilent質(zhì)譜儀;德國布魯克公司Bruker-Avance DRX-400MHZ和Bruker AVANCE-500核磁共振儀, DMSO-d6/CDCl3為溶劑, TMS 為內(nèi)標(biāo);日本島津 EDX-720 型熒光光譜儀; 德國Bruker Apex IV型高分辨液-質(zhì)聯(lián)用儀．所用藥品均為分析純試劑．

1.2 實驗方法

1.2.1 一步法合成熒光素母環(huán)

熒光素衍生物1的合成[32]和絡(luò)合基團(tuán)TPA-Cl的合成參考文獻(xiàn)[39-41]的方法．

化合物2的合成步驟如下[42]：稱取適量的化合物1(280 mg,1.5 mmol)和無水碳酸鉀(414 mg,3 mmol)溶于3 mL無水DMF中,加入碘甲烷(186 μL,3 mmol)．混合液置于55 ℃油浴下攪拌反應(yīng)30 min，待混合液冷卻至室溫后加入10 mL飽和碳酸氫鈉溶液以淬滅反應(yīng),然后混合液用乙酸乙酯(3×10 mL)萃取．合并有機(jī)相,并用無水Na2SO4干燥．經(jīng)減壓旋蒸濃縮后,用油泵抽走DMF后得粗產(chǎn)物,通過硅膠快速色譜法(VDCM∶VMeOH=50 ∶1)純化,得367 mg紅色固體2,產(chǎn)率為81%．1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ:7.50 (d, J=2.4 Hz, 2H), 7.28 (dd, J=6.6, 2.9 Hz, 2H), 7.21～7.00 (m, 3H), 6.88 (d, J=2.4 Hz, 1H), 6.71 (dd, J=9.0, 2.5 Hz, 1H), 6.52 (dd, J=9.7, 1.9 Hz, 1H), 6.39 (d, J=1.9 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H).

熒光素類衍生物熒光分子探針FluTPA’-1的合成:將化合物2(151 mg,0.5 mmol)加入反應(yīng)管并抽充氮?dú)?次,加入無水THF(2 mL)后,置于-78 ℃下攪拌反應(yīng)10 min．在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入四氫鋁鋰(152 mg,4 mmol),攪拌5 min，反應(yīng)升溫至室溫并繼續(xù)反應(yīng)30 min,溶液由橙紅色變?yōu)榛疑尤?0 mL 1mol/L稀硫酸溶液淬滅反應(yīng)后,用乙醚(3×5 mL)萃取，合并有機(jī)相,用無水Na2SO4干燥．經(jīng)減壓旋蒸濃縮后,得不穩(wěn)定化合物3的粗產(chǎn)品，然后進(jìn)行下一步反應(yīng)．

氮?dú)獗Ｗo(hù)下,依次加入無水碳酸鉀(552 mg,4 mmol)、KI(17 mg,0.1 mmol)、配體TPA-Cl(135 mg,0.4 mmol)和無水DMF(2 mL)于裝有化合物3粗產(chǎn)品的反應(yīng)瓶中．混合液在室溫下攪拌5 min后,加熱至90 ℃下反應(yīng)2 h后直接用油泵抽除DMF，得到粗產(chǎn)物,并用硅膠快速色譜法(VDCM∶VMeOH=20 ∶1)純化,得201 mg淺棕色油狀物質(zhì),產(chǎn)率為83%．1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.44 (d, J=4.1 Hz, 2H), 7.58 ～7.52 (m, 3H), 7.50 (d, J=7.8 Hz, 2H), 7.42 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.27 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.18～7.13 (m, 2H), 7.10～7.01 (m, 5H), 6.80 (dd, J=8.8, 4.4 Hz, 2H), 6.64(d,J=2.5 Hz,1H), 6.54 (dt, J=5.8, 2.9 Hz, 2H), 6.45 (dd, J=8.5, 2.6 Hz, 1H), 5.07 (s, 2H), 5.02 (s, 1H), 3.83 (d, J=2.8 Hz, 6H), 3.68 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ:159.25, 159.16, 158.87, 158.07, 156.41, 151.52, 151.49, 149.03, 147.04, 137.29, 136.56, 130.52, 130.40, 128.68, 128.38, 126.52, 123.06, 122.11, 121.85, 119.54, 117.21, 116.58, 110.72, 110.26, 102.33, 101.08, 70.78, 60.17, 60.09, 55.40, 43.16. HRMS (EI), m/z: [M+H] Calcd for C39H35N4O3607.2704, found 607.2696.

1.2.2 多步法合成熒光素母環(huán)

化合物6、8、9和10的合成參考文獻(xiàn)[36-38, 43]的方法．

化合物11的合成:將化合物10(477 mg,1.5 mmol)和無水碳酸鉀(408 mg,3 mmol)溶于3 mL 無水DMF中,加入碘甲烷(186 μL,3 mmol),反應(yīng)混合液加熱至55 ℃攪拌反應(yīng)30 min．用10 mL飽和碳酸氫鈉溶液淬滅反應(yīng),用乙酸乙酯(3×10 mL)萃取，合并有機(jī)相,用Na2SO4干燥．經(jīng)減壓旋蒸濃縮后,用油泵抽除DMF后得粗產(chǎn)品,用硅膠快速色譜法(VDCM∶VMeOH=50 ∶1)純化,得到413 mg紅色固體11,產(chǎn)率為83%．1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ∶7.62 (ddd, J=8.3, 7.4, 1.8 Hz, 1H), 7.35～7.27 (m, 2H), 7.25～7.16 (m, 2H), 7.05 ～6.90 (m, 3H), 6.44 (dd, J=9.7, 1.9 Hz, 1H), 6.23 (d, J=2.0 Hz, 1H), 3.92 (s, 3H), 3.71 (s, 3H).

化合物12的合成:將化合物11(166 mg,0.5 mmol)加入反應(yīng)管并抽充氮?dú)?次,加入無水THF(2 mL)，隨后置于-78 ℃下攪拌反應(yīng)10 min,在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入四氫鋁鋰(20 mg,4 mmol)，攪拌5 min．反應(yīng)升溫至室溫并繼續(xù)反應(yīng)30 min,溶液由橙紅色變?yōu)榛疑尤?0 mL 1mol/L稀硫酸溶液淬滅反應(yīng)后，用乙醚(3×5 mL)萃取,合并有機(jī)相,用無水Na2SO4干燥．經(jīng)減壓旋蒸濃縮后,用硅膠快速色譜法(VDCM∶VMeOH=50 ∶1)純化,得107 mg還原型熒光素12,產(chǎn)率為64%．1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ∶7.17 (ddd, J=8.2, 7.2, 1.8 Hz, 1H), 7.06～6.88 (m, 4H), 6.85 (td, J=7.4, 1.1 Hz, 1H), 6.64 (dd, J=21.4, 2.6 Hz, 2H), 6.52 (ddd, J=38.3, 8.4, 2.6 Hz, 2H), 5.70 (s, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.82 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ:159.00, 156.29, 154.95, 152.04, 151.94, 135.92, 130.37, 130.12, 127.52, 121.11, 117.31, 117.10, 111.10, 110.77, 110.02, 102.91, 100.98, 55.64, 55.41, 35.76.

熒光素類探針FluTPA’-2的合成:在氮?dú)獗Ｗo(hù)下,將碳酸鉀(552 mg,4 mmol)、KI(17 mg,0.1 mmol)、還原型羅丹明化合物12(150 mg,0.45 mmol)和配體TPA-Cl(130 mg,0.4 mmol)依次加入反應(yīng)瓶中,最后加入2 mL無水DMF．混合液在室溫下攪拌5 min,隨后加熱至90 ℃繼續(xù)反應(yīng)2 h．待冷卻至室溫后,用油泵抽除DMF得粗產(chǎn)品,并通過硅膠快速色譜法(VDCM∶VMeOH=20 ∶1)純化，得211 mg淺棕色固體,即熒光素類探針FluTPA’-2,產(chǎn)率為83%．1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ∶ 8.54～8.43 (m, 2H), 7.84～7.70 (m, 3H), 7.57 (dd, J=17.6, 7.8 Hz, 3H), 7.36 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.24 (ddd, J=7.5, 4.9, 1.2 Hz, 2H), 7.13 (dt, J=8.7, 4.5 Hz, 1H), 7.03～6.91 (m, 3H), 6.86～6.74 (m, 3H), 6.73 ～6.52 (m, 3H), 5.58 (s, 1H), 5.14 (s, 2H), 3.85～3.71 (m, 12H).13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ:159.32, 159.24, 159.16, 158.12, 156.33,151.88, 151.85, 149.28, 137.92, 137.00, 135.85, 130.42, 130.34, 129.69, 128.11, 123.08, 122.61, 122.04, 121.20, 120.41, 117.42, 116.85, 112.10, 111.19, 110.57, 102.32, 101.26, 70.97, 59.87, 59.74, 56.11, 55.69, 35.81. HRMS (EI), m/z: [M+H] Calcd for C40H37N4O4637.2809, found 637.2803.

1.3 熒光光譜測定

探針分子儲備液配制:稱取一定量的FluTPA’-1和FluTPA’-2溶解在HEPES緩沖溶液(2 μmol/L HEPES,pH=7.2, CH3CN-H2O(V/V=24 ∶1))中,配制成濃度分別為5 μmol/L和1 μmol/L的探針分子儲備液．

金屬離子儲備液制備:準(zhǔn)確稱量一定量的Co(NO3)2·6H2O、Zn(NO3)2·6H2O、Fe(NO3)3·9H2O、NaNO3、Ni(NO3)2·6H2O、Cu(NO3)2·3H2O、Cr(NO3)3·9H2O、Bi(NO3)3·5H20、AgNO3、MnCl2·H2O、SnCl2、AlCl3、PdCl2、FeCl2·4H2O及C8H12CuF6N4P等無機(jī)鹽類,溶解于HEPES 緩沖溶液 (2 μM HEPES,pH=7.2, CH3CN-H2O(V/V=24 ∶1))中,配制成濃度分別為2 μmol/L和5μmol/L的各離子儲備液．

熒光光譜測定條件:室溫下，狹縫寬度為2 nm,激發(fā)波長為460 nm,測試熒光波長范圍為350～750 nm．除測試與Cu+最佳反應(yīng)時間的實驗外,其他加有金屬離子的測試液的光譜均在探針離子與金屬離子混合2 h后進(jìn)行．

2 結(jié)果與討論

2.1 合成過程的嘗試及遇到的問題

合成過程中主要嘗試了一步縮合法和多步合成法構(gòu)建熒光素母環(huán)．其中,用一步縮法合成了9-Ph取代的 FluTPA’-1．雖然此反應(yīng)步驟簡短,操作簡單,但反應(yīng)底物具有較大局限性,對于富電子的芳香醛不太適用；此外,其產(chǎn)率較低．而用多步合成法制備FluTPA’-2時,先合環(huán)制備熒光酮,之后再與相應(yīng)的格氏試劑反應(yīng)制備出各種9號位芳香取代的熒光素反應(yīng)．整個反應(yīng)的步驟雖較多,但均為成熟的反應(yīng)類型．因此，改變格氏試劑可以制備9號位不同取代的產(chǎn)物．

2.2新型熒光素類Cu+熒光探針的性能研究

文中對熒光探針的如下性能進(jìn)行了測試:(1)具有不同9號位取代芳基的熒光素探針分子(探針-1和探針-2)對Cu+的響應(yīng);(2)對pH穩(wěn)定性的測試;(3)穩(wěn)定性測試;(4)離子選擇性;(5)與Cu+絡(luò)合的工作曲線(Job’s plot)．

2.2.1 探針分子絡(luò)合Cu+后的熒光強(qiáng)度變化

首先測試了FluTPA’-1(9-Ph)或FluTPA’-2(9-(2-OMe)Ph)的探針分子與Cu+反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度變化(圖3),并由此得出兩種探針分子中9-Ar性質(zhì)對于此類探針性質(zhì)的影響．由測試結(jié)果可發(fā)現(xiàn):空白的FluTPA’-1和FluTPA’-2溶液在λ≥500 nm時沒有明顯的熒光變化．但是,加入1 equiv. Cu+后,FluTPA’-1在λ=533 nm處有明顯的熒光發(fā)射．而熒光探針FluTPA’-2在加入1 equiv. Cu+后沒有表現(xiàn)出顯著的熒光增強(qiáng)．因此,和文獻(xiàn)[32]的FluTPA的探針相比:FluTPA’-2的9位苯基的鄰位上有供電能力強(qiáng)于Me的基團(tuán)的OMe存在時,該類探針絡(luò)合Cu+后,其與TPA相連的芐氧基不能及時斷裂,生成相應(yīng)的熒光素,而實現(xiàn)探針分子的熒光“開啟”狀態(tài)．當(dāng)9號位Ph上無取代基時,絡(luò)合Cu+后發(fā)現(xiàn)了反應(yīng),并且實現(xiàn)了熒光發(fā)射波長的紅移(從513 nm到533 nm變化)．這證實了設(shè)計時的思路:沒有任何取代的苯基與熒光素母環(huán)更傾向處于同一平面,從而能實現(xiàn)最終的熒光素類衍生物具有更大的共軛面,進(jìn)而引起發(fā)射波長的紅移和熒光強(qiáng)度的增加．

圖3 FluTPA’-1與FluTPA’-2對Cu+的熒光響應(yīng)Fig.3 Fluorescence response of FluTPA’-1 and FluTPA’-2 to Cu+

2.2.2 FluTPA’-1在不同pH下的穩(wěn)定性

配置pH值依次為1.0、2.1、3.0、4.1、5.0、6.0、7.1、8.0、9.0、10.0的1 μmol/L的FluTPA’-1(加有1equiv. Cu+)的儲備液(2 mM HEPES,pH=7.2, CH3CN-H2O(V/V=24 ∶1)),測試其熒光發(fā)射光譜，見圖4．由圖可知:隨著pH的變化,探針分子的熒光強(qiáng)度也會隨之變化．pH在1～5之間時,熒光強(qiáng)度隨著pH值的增大略微增強(qiáng);當(dāng)57時,熒光強(qiáng)度略有降低．因此，文中選擇生理pH(7.2)作為后期的測試條件．

圖4 pH對探針分子FluTPA’-1熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of pH on the fluorescence intensity of the FluTPA’-1

2.2.3 FluTPA’-1與Cu+反應(yīng)時間的檢測

每隔2 min測試1次1 μmol/L的FluTPA’-1與1equiv. Cu+離子的混合溶液(2 mM HEPES,pH=7.2, CH3CN-H2O (V/V=24 ∶1))的熒光發(fā)射光譜(圖5)．從圖中可以看出:隨著絡(luò)合時間的延長,在λ=533 nm處,熒光強(qiáng)度也隨之增強(qiáng),當(dāng)絡(luò)合時間超過120 min時,熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定．因此,此探針分子FluTPA’-1與Cu+的反應(yīng)在2 h內(nèi)幾乎進(jìn)行完全．隨后的測試均在探針分子FluTPA’-1與Cu+混合2 h后進(jìn)行．

圖5 FluTPA’-1與Cu+絡(luò)合時間穩(wěn)定性Fig.5 Complexation time stability of FluTPA’-1 with Cu+

2.2.4 FluTPA’-1的離子選擇性

測試了熒光探針FluTPA’-1對不同金屬離子的選擇性．首先,向FluTPA’-1的空白測試液中分別加入各離子儲備液(Co(NO3)2·6H2O、Zn(NO3)2·6H2O、Fe(NO3)3·9H2O、NaNO3、Ni(NO3)2·6H2O、Cu(NO3)2·3H2O、Cr(NO3)3·9H2O、Bi(NO3)3·5H20、AgNO3、MnCl2·2H2O、SnCl2、AlCl3、PdCl2、FeCl2·4H2O),混合均勻配制成濃度為5 μmol/L FluTPA’-1+Mn+的測試溶液，測試其熒光光譜，結(jié)果見圖6.

圖6 FluTPA’-1離子選擇性Fig.6 Ion selectivity of FluTPA’-1

從圖中可看出，加入Cu+的測試液的熒光強(qiáng)度明顯高于加入其他金屬陽離子的測試液的熒光強(qiáng)度,FluTPA’-1對Cu+表現(xiàn)出極好的選擇性．

2.2.5 FluTPA’-1與Cu+反應(yīng)的Job’s plot實驗

為了進(jìn)一步確定FluTPA’-1與Cu+絡(luò)合的最佳反應(yīng)比例，進(jìn)行了Job’s Plot實驗．用HEPES 緩沖液 (2 mmol/L HEPES,pH=7.2, CH3CN-H2O(V/V=24 ∶1))配置了一系列不同濃度比的FluTPA’-1與Cu+混合溶液,并保持其總濃度為20 μmol/L．所測試的溶液中兩種物質(zhì)的比例分別為[Cu+]/([Cu+]+FluTPA’-1)=0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9．其熒光強(qiáng)度見圖7．由圖可知:當(dāng)[Cu+]/([Cu+]/FluTPA’-1+[Cu+])=0.5時,出現(xiàn)最大熒光強(qiáng)度．因此每個FluTPA’-1分子絡(luò)合一個Cu+就會反應(yīng)生成熒光素．

圖7 FluTPA’-1與Cu+絡(luò)合后的Job’s plot實驗Fig.7 Job’s plot experiment of FluTPA’-1 complexed with Cu+

3 結(jié)論

采用不同方法合成熒光素母環(huán)各有利弊:對于9號位-簡單芳烴取代的熒光素,可以用一步法構(gòu)建9-Ar熒光素;當(dāng)9-Ar上有供電子基團(tuán)特別是如OCH3等強(qiáng)供電子基團(tuán)時,用一步法合成時所用富電子芳香醛不穩(wěn)定、易聚合．因此先合成熒光酮,再與相應(yīng)的格氏試劑反應(yīng)合成相應(yīng)的熒光素衍生物．合成的兩個化合物FluTPA’-1和FluTPA’-2,僅有苯基合成的探針分子FluTPA’-1對Cu+有熒光響應(yīng)．與類似熒光素探針相比,在保證了相同反應(yīng)活性的前提下,成功實現(xiàn)了熒光發(fā)射波長的紅移(513-533 nm)．而探針分子FluTPA’-2因其苯基鄰位存在甲氧基,導(dǎo)致共軛平面內(nèi)電子云密度較大,影響FluTPA’-2與Cu+絡(luò)合后C-O鍵的斷裂,無法實現(xiàn)探針分子的熒光“開啟”狀態(tài)．同時,通過檢測結(jié)果可知，探針分子FluTPA’-1在pH約為7時與1equiv. 的Cu+絡(luò)合,2 h左右會反應(yīng)生成熒光素,從而顯示出熒光“開啟”狀態(tài)．