浮游態(tài)白念珠菌SC5314標(biāo)準(zhǔn)株及耐藥株自噬的研究

孫凱瑞，姜?jiǎng)Ⅵ蹋?鵬，顧靜怡，徐 瑞，魏 昕

白念珠菌是一種常見的條件致病菌，在50%以上健康人的胃腸道、皮膚和黏膜上均有分布[1]。通常情況下，白念珠菌定植在健康個(gè)體中并不會(huì)引起疾病，然而，當(dāng)宿主的防御功能被破壞時(shí)，白念珠菌會(huì)轉(zhuǎn)化為病原體入侵組織[2]。隨著抗真菌藥物的廣泛使用，白念珠菌耐藥性增加[3]。白念珠菌耐藥機(jī)制主要有：通過激活藥物外排泵來減少細(xì)胞內(nèi)藥物的積累[4]，旁路途徑的產(chǎn)生[5]，以及藥物靶基因的突變[6-7]等。然而，Alizadeh[8]研究耐藥基因時(shí)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，耐藥基因在氟康唑耐藥株并沒有顯著變化；Sardari[9]在氟康唑耐藥株中分離出的41個(gè)突變的密碼子中，只有4個(gè)引起了藥物靶基因的變化，而且這些突變并不會(huì)導(dǎo)致氟康唑耐藥。上述研究表明，白念珠菌耐藥可能還存在其他機(jī)制。

自噬是真核生物中一種高度保守的細(xì)胞過程[10]，通過細(xì)胞外應(yīng)激(營養(yǎng)缺乏或是壓力)和細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激(清除受損細(xì)胞器或蛋白質(zhì)的積累)，降解非必需或功能失調(diào)的細(xì)胞內(nèi)成分，如異常蛋白、衰老的細(xì)胞器和病原體，來調(diào)節(jié)和維持細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)定[11]。自噬有3種類型：伴侶介導(dǎo)的自噬、微自噬和巨自噬[12]。巨自噬(也是通常所稱的自噬)是最典型的自噬[13]，即本文所研究的自噬。

耐藥和自噬之間的關(guān)系，在腫瘤[14-15]、糖尿病[16]和白血病[17]等疾病中研究較多。在抗癌藥物與自噬的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，耐藥的腫瘤細(xì)胞中普遍存在自噬改變[14]。Liu[15]研究藥物調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞自噬時(shí)發(fā)現(xiàn)，替康唑可阻礙腫瘤細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Atg4的活性位點(diǎn)，同時(shí)可積累自噬小體降低細(xì)胞內(nèi)自噬通量，并且可以減弱腫瘤細(xì)胞活力使其對(duì)化療藥物敏感，降低耐藥。另外，研究表明抑制自噬和化療協(xié)同作用可觸發(fā)腫瘤細(xì)胞死亡，改善癌癥治療效果[18]。這提示自噬在藥物敏感性及耐藥中的作用十分重要，自噬激活或增強(qiáng)可能增加抗癌藥物耐藥，促進(jìn)癌癥細(xì)胞的生長。在白念珠菌的研究中，Yu[19]發(fā)現(xiàn)抗真菌藥物治療引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能會(huì)激活自噬，從而抵抗藥物壓力并介導(dǎo)細(xì)胞存活。本課題組在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，自噬相關(guān)基因在氟康唑誘導(dǎo)構(gòu)建的白念珠菌耐藥株和標(biāo)準(zhǔn)株中有著顯著的差異。

本研究旨在探索浮游狀態(tài)白念珠菌耐藥株與標(biāo)準(zhǔn)株自噬的差異，初步探討自噬在白念珠菌耐藥中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株(SC5314)，購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)；白念珠菌耐藥株由本實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)構(gòu)建。KONT真菌顯色MIC藥敏系統(tǒng)穩(wěn)定性檢測(cè)試驗(yàn)條鑒定耐藥株[20]，MIC≥64 μg/mL。

1.1.2 主要試劑 沙堡瓊脂培養(yǎng)基(SDA，6.3 g/100 mL)，YPD培養(yǎng)液(2%葡萄糖，2%胰蛋白胨，1%酵母提取物), RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO公司,美國)，氟康唑(Sigma公司，美國)，XTT工作液(1 μmol/L，Sigma公司，美國)，BCA試劑盒(BCA Protein Assay Kit BioWorld，美國)；堿性磷酸酶試劑盒(碧云天，中國)；雷帕霉素(Rapamycin，Sigma公司，美國)；4%戊二醛固定液(Sigma公司，美國)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 浮游狀態(tài)白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株及耐藥株獲得 取-70 ℃保種的白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株SC5314及耐藥株分別接種到SDA培養(yǎng)基中，5% CO2，37 ℃培養(yǎng)24 h。分別取單克隆菌株于YPD培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min搖床過夜生長16～18 h，達(dá)到對(duì)數(shù)生長期。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR)RT-qPCR檢測(cè)自噬相關(guān)基因表達(dá) 改良熱酚法[21]提取培養(yǎng)24 h的浮游狀白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株及耐藥株總RNA，逆轉(zhuǎn)成cDNA，-20 ℃保存。

RT-qPCR采用iTaq-SYBR Green 預(yù)混酶和ABI 7900進(jìn)行檢測(cè)，10 μL反應(yīng)體系：cDNA(0.05 μL)，基因上下游引物(各0.3 μL)(18rS為內(nèi)參基因，F(xiàn)和R分別是各基因內(nèi)一對(duì)正反向引物)，SYBR green master mix(5 μL)，反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；70 ℃ 20 s；最后4 ℃冷卻。記錄相應(yīng)的Ct值。消除組間的加樣量誤差，重復(fù)3次。ΔΔCt目標(biāo)基因=處理組ΔCt目標(biāo)基因-對(duì)照組ΔCt目標(biāo)基因，基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計(jì)算(引物序列見表1)。

表1 引物序列

1.2.3 堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè)自噬表達(dá) 收集24 h的浮游狀白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株和耐藥株細(xì)胞，BCA法測(cè)定蛋白濃度；按ALP試劑盒說明準(zhǔn)備工作液，并進(jìn)行加樣，充分混勻，37 ℃靜置孵育40 min，于每孔中依次加入100 μL反應(yīng)終止液，多功能酶標(biāo)儀處測(cè)OD405。根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線及測(cè)定的蛋白濃度計(jì)算對(duì)應(yīng)的堿性磷酸酶活性。堿性磷酸酶(U/gprot)=(測(cè)定孔OD值-空白孔OD值)÷(標(biāo)準(zhǔn)孔OD值-空白孔OD值)×酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度÷待測(cè)樣本蛋白濃度。

1.2.4 透射電子顯微鏡觀察自噬現(xiàn)象 收集24 h的白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株及耐藥株細(xì)胞，PBS洗滌2次，離心收集；4%戊二醛4 ℃固定2 h后送樣，透射電鏡下觀察自噬現(xiàn)象。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行分析。采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析，P<0.05則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RT-qPCR檢測(cè)自噬相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果

白念珠菌耐藥株與標(biāo)準(zhǔn)株相比，自噬相關(guān)基因Atg5、Atg8、Atg13和Ccz1表達(dá)上調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1，P<0.05)，而Atg1和Atg9表達(dá)雖呈上調(diào)趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

基因表達(dá)倍數(shù)變化與對(duì)照組(白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株)結(jié)果相關(guān)。采用18rS rRNA對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。數(shù)據(jù)為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;*：P<0.05

2.2 ALP活性檢測(cè)結(jié)果

與白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株相比，耐藥株ALP活性水平上調(diào)(P<0.05)(圖2)，提示自噬水平高。

數(shù)據(jù)為3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;*：P<0.05

2.3 透射電子顯微鏡觀察自噬小體形態(tài)

在標(biāo)準(zhǔn)株中，未觀察到自噬小體的形成(圖3 A1～A3、C1～C3)；而在耐藥株中，可以觀察到自噬小體(圖3 B1～B3、D1～D3)。

A1～A3: 標(biāo)準(zhǔn)株,B1～B3:耐藥株( ×8 000； AP：自噬小體；N：細(xì)胞核);C1～C3: 標(biāo)準(zhǔn)株；D1～D3:耐藥株( ×30 000；AP：自噬小體；N：細(xì)胞核)

3 討 論

迄今為止，在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過40個(gè)自噬相關(guān)(autophagy-related, ATG)基因，其中大多數(shù)在更復(fù)雜的真核生物中具有同源性[22]。在白念珠菌中，自噬相關(guān)基因Atg1、Atg8、Atg9和Ccz1等被鑒定出來[11,19,23-24]。研究表明，白念珠菌通過增高自噬相關(guān)基因(Atg9、Atg2和Lap41) 的表達(dá)，改變細(xì)胞內(nèi)自噬流(autophagic flux)，引發(fā)自噬現(xiàn)象，從而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的壓力，保持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力的平衡，以維護(hù)自身生存[19]。在釀酒酵母自噬研究中發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素靶(target of rapamycin, TOR) 在自噬調(diào)控中起主導(dǎo)作用，直接參與自噬的各個(gè)階段，其中TOR1信號(hào)通路通過與其直接底物自噬蛋白Atg13(autophagy-related proteins 13，Atg13)或Atg1能量傳遞而構(gòu)成自噬調(diào)節(jié)的主軸，Atg1或Atg13磷酸化可逆向調(diào)控TOR1，但其間分子信號(hào)傳遞的詳細(xì)機(jī)制還有待闡明[25]。本研究中，白念珠菌耐藥株與標(biāo)準(zhǔn)株相比，自噬相關(guān)基因Atg5、Atg8、Atg13和Ccz1表達(dá)顯著上調(diào)。而Yu[19]研究在野生型菌株中，盡管氟康唑略微上調(diào)了Atg1的表達(dá)，但對(duì)Atg5和Atg8的表達(dá)均無顯著影響。這似乎與本實(shí)驗(yàn)?zāi)退幹曜允上嚓P(guān)基因Atg5和Atg8的表達(dá)同標(biāo)準(zhǔn)株相比顯著上調(diào)有所不同。但是本研究主要研究的對(duì)象是構(gòu)建誘導(dǎo)形成的穩(wěn)定狀態(tài)的氟康唑耐藥菌株，而Yu[19]研究白念珠菌是通過1.5 μg/mL氟康唑臨時(shí)處理白念珠菌野生株數(shù)小時(shí)對(duì)其進(jìn)行刺激。這或許可以提示白念珠菌耐藥狀態(tài)的不同，會(huì)導(dǎo)致自噬相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生差異。在腫瘤細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，自噬是維持腫瘤細(xì)胞生長所必須的，在刪除必要的自噬相關(guān)基因后，腫瘤細(xì)胞生長受到一定的抑制，表明尋找必要自噬相關(guān)基因有助于靶向治療腫瘤[26]。本實(shí)驗(yàn)白念珠菌自噬相關(guān)基因的研究，有利于尋找和研究白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株和耐藥株必要的自噬相關(guān)基因，對(duì)靶向治療白念珠菌以及解決白念珠菌耐藥問題具有一定的意義。

在酵母中，ALP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中作為非活性前體合成，處于非活性狀態(tài)，并通過分泌途徑轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中[27]。一旦到達(dá)液泡，C′末端的前導(dǎo)肽區(qū)就會(huì)被液泡蛋白酶裂解，導(dǎo)致酶的活性形成[28]。當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，ALP前體隨機(jī)被自噬體吞噬，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡并被激活。ALP前體通過自噬的方式被降解成有活性的酶，因此通過檢測(cè)ALP活性來監(jiān)測(cè)自噬發(fā)生的水平[29]。本研究ALP活性檢測(cè)結(jié)果顯示，耐藥株和標(biāo)準(zhǔn)株相比，ALP活性顯著增加，提示在耐藥株中，自噬水平升高，這進(jìn)一步說明了自噬對(duì)耐藥株和標(biāo)準(zhǔn)株調(diào)節(jié)存在著差異，即自噬可能對(duì)白念珠菌耐藥存在影響。在癌癥、感染和炎性疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，自噬功能障礙與上述多種疾病相關(guān)，它既是發(fā)病機(jī)制的調(diào)節(jié)因子，也是潛在的治療靶點(diǎn)。例如，抑制自噬會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長受到抑制[26]；在對(duì)金黃色葡萄球菌等細(xì)菌的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌可以主動(dòng)誘導(dǎo)自噬，利用自噬成分進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，阻斷細(xì)胞凋亡，促進(jìn)持續(xù)性感染[30]。這些研究表明自噬增強(qiáng)在許多情況下起到調(diào)節(jié)和促進(jìn)細(xì)胞生長的作用。ALP實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是：可以清晰地定量讀數(shù)，還可以測(cè)量非選擇性自噬途徑的通量自噬，因?yàn)樵谶x擇性自噬中，隔離膜特異性地包繞被容物，不會(huì)包括其他細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)。然而，ALP實(shí)驗(yàn)存在背景信號(hào)的干擾，使得檢測(cè)低水平細(xì)胞自噬變得困難[31]。所以通常需要結(jié)合其他檢測(cè)結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)透射電鏡觀察，標(biāo)準(zhǔn)株中除了細(xì)胞器幾乎沒有自噬小體，而在耐藥株中，盡管不多，但仍然可以看到。透射電鏡的結(jié)果從形態(tài)學(xué)上提示耐藥株和標(biāo)準(zhǔn)株之間自噬存在著差異，更進(jìn)一步說明自噬對(duì)耐藥可能存在影響。透射電鏡是觀察自噬小體的金標(biāo)準(zhǔn)，但是不便于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)自噬[32]。通常用于自噬流監(jiān)測(cè)的方法是熒光標(biāo)記物綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)來標(biāo)記自噬相關(guān)蛋白如Atg8等[33]。

綜上所述，浮游狀態(tài)白念珠菌耐藥株和標(biāo)準(zhǔn)株之間的自噬存在差異，提示白念珠菌耐藥性的產(chǎn)生，可能存在自噬的調(diào)節(jié)作用。而自噬在白念珠菌耐藥的具體作用和機(jī)制還需進(jìn)一步研究。