5’- 核苷酸酶不同檢測系統(tǒng)測量結果一致性探討

錢志平，陳蕾，徐俊馳，楊玉婷，王鳳平，惠李

（1. 蘇州市廣濟醫(yī)院，江蘇 蘇州215008；2．蘇州市第五人民醫(yī)院檢驗中心，江蘇 蘇州215007）

臨床檢驗量值溯源受到國際廣泛重視,檢驗結果的準確在疾病診斷、危險因素分析、治療效果評價以及健康狀況監(jiān)測重要依據(jù)。 目前臨床醫(yī)學實驗室量值溯源主要從兩個環(huán)節(jié)體現(xiàn),一是用于正確性評價定值參考物（即標準物質或產品校準物）,二是臨床實驗室檢驗結果一致性（實驗室間比對）[1]?，F(xiàn)臨床實驗室使用有注冊證商品試劑盒或分析系統(tǒng)對標準物或產品校準物的溯源由為重要,是評價臨床檢驗結果正確性和一致性的依據(jù)。 5’-核苷酸酶（5’-Nucleotidase，5’-NT）分布于心、肝、腦、腎等組織，在肝內分布膽小管和肝竇間隙[2]。 眾多文獻表明血清5’-NT 主要用于肝膽系統(tǒng)疾病和某些惡性腫瘤的診斷和鑒別診斷, 與其它生化指標如r-GT、AST、ALP、LAP 等在相關疾病診斷與病情預后判斷存在量值關系[3]。 5’-NT 項目衛(wèi)生部或省臨檢中心并未開展室間質量評價（EQA）對實驗室間檢測能力一致性驗證，按照ISO15189 文件和GP29-A 文件采用替代方案實驗室間比對[4,5]。本實驗室利用幾家國產5’-NT 試劑初步評估發(fā)現(xiàn), 盡管各家試劑說明書提供參考范圍基本一致,但是實際檢測同一樣本時差異較大,對臨床實驗室選擇合適產品帶來很大困擾。

1 材料與方法

1.1 檢驗系統(tǒng)的組成 選擇《蘇州市醫(yī)療衛(wèi)生機構醫(yī)用耗材及試劑中標目錄》5’-NT 商品試劑共6家，方法學均為過氧化物酶法。 廠家試劑、配套校準品、 質控與日立全自動生化分析儀7600-110E（日立7600-P）組成6 個檢測系統(tǒng)。 實驗中使用儀器及設備定期進行校準,各項指標均符合實驗儀器性能及計量學要求。 考慮到本實驗結果僅對不同檢驗系統(tǒng)臨床樣本檢測結果一致性評價,不能對結果準確性驗證,實驗結果評價可能對選擇試劑廠家產生影響，故廠家用A、B、C、D、E、F 代替。 各廠家商品試劑主要成份及溯源情況見表1。

1.2 實驗樣本的選擇 通過醫(yī)院檢驗LIS 系統(tǒng)從每日常規(guī)檢測血清樣本中篩選比對實驗樣本, 要求5’-NT 檢測值高、中、低濃度，覆蓋線性范圍內不同濃度臨床患者樣本，樣本無溶血、脂血，分裝于血清專用樣本管，于-20℃保存待用。生物參考區(qū)間驗證樣本,隨機選擇來院健康體檢個體20 名，年齡分布18～55 歲，男女比例1：1。健康個體選擇原則，健康人群評價指標及體格檢查達到標準或評價指標陰性，排除非健康個體，實驗室免疫學、生化學及尿檢均正常。

1.3 5’-NT 純品酶校準品 Sigma 純品酶，CAS 號9027-73，貨號N8661，用生理鹽水配制成101U/L，廠家加入少量穩(wěn)定劑及激活劑（A 廠家提供）。

1.4 不同檢驗系統(tǒng)5’-NT 比對實驗 實驗按照ISO15189 文件和GP29-A 文件替代評估方案要求，各廠家試劑及配套校準品、質控與日立7600-P組成6 個不同檢測系統(tǒng)。 各試劑廠家均按照試劑說明書要求進行參數(shù)設定，校準及質控結果確認。本次以A 廠家試劑與日立7600-P 為對照檢測系統(tǒng)，用于5’-NT 在不同檢測系統(tǒng)比對一致性評價。

1.5 各試劑校準品、 質控5’-NT 檢測結果一致性利用Sigma 5’-NT 純品酶校準品與各廠家試劑及日立7600-P 組成檢測系統(tǒng)， 觀察各試劑校準品、質控5’-NT 檢測結果一致性。

1.6 新鮮混合血清進行賦值 利用A 廠家5’-NT試劑并采用理論K 值與日立7600-P 組成檢測系統(tǒng)，對新鮮混合血清進行賦值，并進行賦值確認，即利用賦值混合血清作為校準品與A 廠家試劑配套，測定Sigma 5’-NT 純品酶校準品<±10%為偏差較小，可接受。

1.7 評價在不同檢測系統(tǒng)5’-NT 結果比對一致性及各試劑廠家生物參考區(qū)間驗證 利用賦值混合血清為校準品與各廠家試劑及日立7600-P 組成檢測系統(tǒng)， 評價在不同檢測系統(tǒng)5’-NT 結果比對一致性及各試劑廠家生物參考區(qū)間驗證。

1.8 統(tǒng)計分析 使用單因素方差(One-way analysis)分析組間樣本差異，Dunnett's test 作兩兩比較分析,P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。 統(tǒng)計分析使用數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析繪圖軟件GraphPad Prism 5.0。

表1 各廠家商品試劑主要內容及溯源情況

2 結果

各廠家5’-NT 試劑及校準品與日立7600-P組成不同檢測系統(tǒng)檢測30 份低、中、高篩選實驗比對樣本結果，組間樣本均數(shù)分別40.1U/L、32.9U/L、11.7U/L、16.5U/L、11.1U/L、43.1U/L，經(jīng)單因素方差分析(One-way analysis)發(fā)現(xiàn)各廠家標準校準后檢測結果組間存在差異,用Dunnett's test 以A 組為對照與C、D、E 組做兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義，P<0.0001。 見表2 。

賦值后混合血清為校準品與各廠家試劑及日立7600-P 組成檢測系統(tǒng)， 組間樣本均數(shù)分別40.3U/L、29.9U/L、34.8U/L、41.2U/L、32.7U/L、37.7U/L。 經(jīng)單因素方差分析(One-way analysis)發(fā)現(xiàn)以理論K 值賦值血清校準后組間差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05。 見表2。

5’-NT 在不同檢測系統(tǒng)不同校準模式下各試劑配套質控及純酶品檢測結果,利用各廠家配套校準品組成檢測系統(tǒng)配套質控測值均在可接受范圍,其中C、D 廠家與A 廠家5 ‘-NT 純酶測值較一致（5‘-NT 純酶理論值101U/L）,而B、F 廠家5‘-NT純酶品測量較A 廠家高約三倍。 而5‘-NT 純酶校準后各廠家質控檢測，C、D、E 配套質控可接受，B、F 廠家配套質控測值約為目標值1/3。 A 廠家檢測系統(tǒng)賦值混合血清校準后質控結果，B、F 廠家質控可接受, 而C、D、E 三家測值約為目標值三倍，5‘-NT 純酶測值除A 廠家外，均達二倍以上。 見表3。

5’-NT 在廠家配套校準及賦值血清校準模式下組成測量系統(tǒng)對30 份低、中、高實驗樣本檢測結果，各廠家配套校準模式樣本均數(shù)離散較明顯，而理論K 值賦值血清校準后各組樣本均數(shù)趨于一致,以A 組為對照經(jīng)相關性分析發(fā)現(xiàn)各組均有較好的相關性，見圖1、圖2。

生物參考區(qū)間驗證程序， 按健康人群評價指標排除非健康個體20 例樣本檢測結果，除D 廠家30%樣本測值超過廠家建議參考值，不符合驗證程序（<10%）,其余5 家1 例樣本結果超過參考值區(qū)間，符合驗證程序。

3 討論

5’-NT 是一種磷酸水解酶,血清酶活性升高主要用于肝膽系統(tǒng)疾病以及與其它疾病鑒別診斷，5’-NT 上升程度及其它相關生化指標如ALP、r-GT 等呈量值關系[6]。 從選擇的幾家國產試劑發(fā)現(xiàn)檢測同一樣本存在較大差異,對終端用戶選擇產品帶來很大困擾。 本研究選擇6 家國產商品試劑采取廠家配套校準、 理論K 值賦值血清兩種校準模式探討臨床樣本檢測一致性評價。

從表2 可見, 選擇6 家5’-NT 商品試劑采用廠家配套校準方式與日立7600-P 組成檢測系統(tǒng)30 份實驗樣本結果顯示, 組間樣本均數(shù)離散較明顯，同一份樣本不同檢測系統(tǒng)差值近達四倍，經(jīng)單因素方差分析組間存在差異,用Dunnett's test 分析并以A 組為對照與其它五組做兩兩較，C、D、E 組差異有統(tǒng)計學意義，P<0.0001。 本實驗選用5’-NT試劑均為以5’-次黃嘌呤核苷酸為底物，生成的過氧化氫與苯胺鹽和4-AAP 在過氧化物酶作用形成醌亞胺類化合物,通過吸光度速率變化計算5’-NT活性。 5’-NT 項目衛(wèi)生部、省臨床檢驗中心未開展室間質量評價, 屬無能力驗證制造商選定測量程序,廠家量值溯源區(qū)別在于制造商對工作校準品賦值方式[7,8]。 A 廠家理論K 值確定以次黃嘌呤為標準，采用雙波長Trinder‘s 反應監(jiān)測5’-NT 反應速率,并利用5’-NT 定量濃度Sigma 純品酶對原廠試劑采用理論K 值組成檢測系統(tǒng)進行量值傳遞驗證,使測量結果的可溯源性及不確定度<±10%，故本次實驗以A 廠家試劑為對照組。 表3 顯示，廠家配套校準模式下配套校準品及質控檢測均可接受，5’-NT 純酶測值C、D、E 與A 廠家較一致, 且5’-NT純酶校準后，C、D、E 三家配套質控在控, 但是表2顯示臨床比對樣本檢測組間存在顯著性差異。 分析原因酶校準品生產及長期保存原因,制造過程需加入穩(wěn)定劑、激活劑等，或校準品非人源物質，產生不同程度基質效應[9]。 廠家配制純酶品只適合自身測量系統(tǒng)評價,對于其它測量系統(tǒng)采用比對廠家純酶為校準物質可能出現(xiàn)臨床樣本測值差異。

圖1 5’-NT 各廠家配套校準模式

圖2 5’-NT 理論K 值賦值血清校準模式

5’-NT 無國際、國家標準參考物及參考方法屬制造商選定測量程序,對于部分廠家采用純品酶制備產品校準物在其自身系統(tǒng)內可很好將測量結果在選定測量程度和常規(guī)測定方法進行量值傳遞，但對于其它廠家可能存在不通用性[10]。而利用賦值新鮮混合血清為校準品可使不同檢測系統(tǒng)酶測量結果有互通性， 組間差異縮小并且比對結果達到一致性[11,12]。表2 可見A 廠家5’-NT 試劑采用理論K 值與日立生化7600-P 組成對新鮮混合血清賦值,其余廠家以賦值血清為校準物與日立生化組成測量系統(tǒng),檢測30 份實驗比對樣本。從表2 顯示組間樣本均數(shù)趨于一致, 經(jīng)One-way analysis 分析組間差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05。 另廠家配套校準和賦值血清校準模式下30 份比對實驗樣本，以A 廠家為對照組經(jīng)相關性分析組間存在顯著性相關（r2>0.95，P<0.001）,見圖1、圖2。 分析廠家配套校準模式下出現(xiàn)實驗比對樣本均數(shù)離散且方差分析組間有顯著性差異,進一步佐證說明現(xiàn)用部分5’-NT 試劑廠家工作校準品的量值溯源及常規(guī)校準品的量值傳遞不嚴謹。 表4 顯示在理論K 值賦值混合血清校準模式下,排除非健康個體生物參考區(qū)間驗證20 例樣本檢測結果，5 家均只有1 例結果超過參考值范圍，符合驗證程序，D 廠家有30%樣本結果超參考區(qū)間,不符合生物參考區(qū)間驗證程序要求（<10%）[13]。 分析考慮5’-NT 在選定測量程序和常規(guī)測量程序以及量值傳遞過程存在不確定度的增加， 如不確定度按<±10%， 則D 廠家僅2 例超范圍符合生物參考區(qū)間驗證。

通過5’-NT 在不同檢測系統(tǒng)實現(xiàn)實驗室結果一致性研究,醫(yī)學臨床實驗室對無能力驗證項目在選擇商品試劑時應充分考慮產品制造量值溯源及區(qū)域實驗室比對方法, 從5’-NT 三種量值溯源方式， 作為終端用戶應選擇采用理論k 值或賦值混合血清為校準品實驗室間比對,才能保持臨床樣本結果一致性。