循環(huán)腫瘤細(xì)胞在腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用淺析

鄒暢，趙盼，胡鳳艷

（深圳市人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心 暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 深圳518020）

惡性腫瘤已成為嚴(yán)重威脅中國人群健康的主要公共衛(wèi)生問題,國家癌癥中心最新的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，惡性腫瘤死亡占居民全部死因的23.91%，且近十幾年來惡性腫瘤的發(fā)病死亡均呈持續(xù)上升態(tài)勢(shì)。 腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)是一種基于腫瘤病人“定制”的醫(yī)療模式，即“對(duì)癥下藥”,根據(jù)每個(gè)腫瘤患者個(gè)體特征而定制和實(shí)施個(gè)性化治療方案。 癌癥精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)診斷檢查不僅限于基因和蛋白檢測(cè), 包括遺傳、分子及細(xì)胞學(xué)信息、生活方式、環(huán)境信息達(dá)到在內(nèi)的大數(shù)據(jù)綜合分析，旨在實(shí)現(xiàn)精確診斷[1]。 無創(chuàng)診療是腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要方向,目前臨床應(yīng)用較多的主要是基于循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulation tumor cell，CTC）和循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）的精準(zhǔn)診療檢測(cè)產(chǎn)品[1]。 CTC 是指來源于原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移灶中能脫離基底膜并能通過組織基質(zhì)入侵到外周血中的腫瘤細(xì)胞[1,2], CTC 可動(dòng)態(tài)反應(yīng)腫瘤的疾病進(jìn)展,為腫瘤的早期診斷、預(yù)后評(píng)估、療效監(jiān)測(cè)、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移檢測(cè)、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和個(gè)體化診療等，為腫瘤診療提供了一種簡(jiǎn)便快捷的手段[1]。

1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞的生物特性

CTCs 自身存在某些物理特性。第一，數(shù)量的稀有性[3]：CTCs 在外周血液中的含量極低，每毫升人外周血中檢測(cè)到的CTC 不到1 個(gè), 而外周血液循壞中的紅、白、血小板等成分的數(shù)量級(jí)又十分巨大[4]。 第二，形態(tài)的非典型性[3]：CTCs 從原發(fā)部位或者轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入血液循環(huán)后,隨著血液循環(huán)的快速流動(dòng),并在流動(dòng)過程中受到血管壁的物理擠壓和機(jī)體免疫系統(tǒng)以及藥物的化學(xué)攻擊等作用, 導(dǎo)致CTCs 的大小,形態(tài),以及表型等發(fā)生未知的改變。第三，CTCs 的異質(zhì)性[3]：腫瘤在發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中會(huì)出現(xiàn)時(shí)間和空間上的異質(zhì)性, 在這過程中CTCs 發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）,CTCs 表型動(dòng)態(tài)變化。第四,具有更大的核質(zhì)比，細(xì)胞核的形態(tài)各異[5]。 細(xì)胞形態(tài)的改變是機(jī)械性能改變的基礎(chǔ),并為CTCs 提供多種功能。這種柔韌性可以促進(jìn)它們從原發(fā)性腫瘤侵入遠(yuǎn)端部位,并且可以賦予它們抵抗在轉(zhuǎn)移過程中受到血管內(nèi)流體剪切應(yīng)力損害的能力[6]。 也影響了它們的表面電荷和電性能。 以上特性使得CTCs 的微量捕獲和高靈敏的檢測(cè)成為后續(xù)分析的重要前提。

2 循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集、檢測(cè)和分析方法

2.1 CTCs 的分離富集技術(shù) ⑴基于CTCs 和正常血液細(xì)胞在大小、 形態(tài)等方面存在差異特征分離CTCs。 通過設(shè)計(jì)一定濾過孔徑的聚碳酸酯膜，依據(jù)腫瘤細(xì)胞比正常血細(xì)胞直徑大的原理分離CTCs稱為ISET(Isolation by size of epithelial tumor cells)方法[7]。 通過此物理特征分離出的CTCs 形態(tài)完整，細(xì)胞表面表達(dá)的抗原未遭破壞,為后續(xù)進(jìn)行免疫標(biāo)記、染色等鑒定提供了可行性和準(zhǔn)確性。 但外周血中的也存在著許多大體積細(xì)胞，又有部分CTCs 體積較血細(xì)胞相似甚至更小,從而降低了該分離方法的靈敏度和特異度。 ⑵基于CTCs 與其他血細(xì)胞表面抗原的差異以分離檢測(cè)CTCs。由于大部分CTCs表達(dá)細(xì)胞角蛋白（CK）,上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)等上皮細(xì)胞標(biāo)記, 通過靶向腫瘤細(xì)胞特異性抗原（CK、EpCAM） 的正向富集和靶向白細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物（CD45）的反向分離來進(jìn)行免疫識(shí)別[8]。在免疫識(shí)別的基礎(chǔ)上結(jié)合特殊材料如：納米芯片，微流控，免疫磁珠等以實(shí)現(xiàn)CTCs 的有效分離[9]。 這類方法富集到的CTCs 特異性強(qiáng)，純度高。 但由于CTCs會(huì)發(fā)生EMT,使得利用上皮標(biāo)志物的正向富集會(huì)遺漏具有轉(zhuǎn)移能力的那部分CTCs。因此，在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上發(fā)展出更高效的, 特異性更強(qiáng)的通用的CTCs的腫瘤標(biāo)記是一大要克服的難題。

2.2 CTCs 的識(shí)別鑒定技術(shù) CTCs 的鑒定通常采用免疫細(xì)胞化學(xué)法（ICC），基于核酸的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR），流式細(xì)胞術(shù)（FCM），熒光原位雜交（FISH），CanPatrol CTC 分型檢測(cè)技術(shù)等[8]。其中ICC 是將待檢測(cè)的細(xì)胞固定后,依據(jù)抗原抗體特異結(jié)合的基本原理,與熒光標(biāo)記的細(xì)胞上皮性特異性抗原如EpCAM、CK 等的抗體進(jìn)行結(jié)合。同時(shí)，在體系里加抗白細(xì)胞抗體來排除假陽性。 RT-PCR是從RNA 水平上進(jìn)行的檢測(cè),因CTCs 表達(dá)特異性的mRNA，而正常血細(xì)胞中不表達(dá)的差異來進(jìn)行鑒定。 但該檢測(cè)方法需要破壞細(xì)胞的形態(tài)且敏感性偏低[10]。 FCM 是借助單克隆抗體和熒光染料結(jié)合CTCs 進(jìn)行染色,而后對(duì)染色的CTCs 進(jìn)行定量分析的技術(shù)。 可同時(shí)使用多種染料對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記來提高特異性[11]。 FISH 是利用熒光素標(biāo)記的核酸探針對(duì)CTCs 進(jìn)行檢測(cè)。 此方法加入探針技術(shù)具有更高的敏感度和特異性,但這些優(yōu)勢(shì)是在靶細(xì)胞的表面抗原標(biāo)記是穩(wěn)定狀態(tài)下適用。 CanPatrol CTC分型檢測(cè)技術(shù)運(yùn)用納米膜過濾和RNA 原位雜交技術(shù)，采用針對(duì)上皮、間質(zhì)mRNA 的熒光探針進(jìn)行細(xì)胞原位雜交，將CTC 分為上皮型、間質(zhì)型和混合型，是實(shí)現(xiàn)分型分析的CTC 檢測(cè)技術(shù)。

3 循環(huán)腫瘤細(xì)胞的臨床應(yīng)用

3.1 腫瘤的早期診斷 CTCs 是存在腫瘤患者血液中一種具有活性的腫瘤細(xì)胞,其與惡性腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[12]。 隨著對(duì)CTCs 不同檢測(cè)技術(shù)和分析方法的發(fā)展和不斷的深入認(rèn)識(shí),已越來越多將其應(yīng)用于腫瘤早期診斷、腫瘤分期、惡性腫瘤的輔助診斷和預(yù)后評(píng)估。對(duì)于腫瘤做到早發(fā)現(xiàn),早治療，才能達(dá)到好的療效,目前早期診斷一般為影像學(xué)檢查，但該檢查對(duì)直徑小于5mm 的腫塊難以發(fā)現(xiàn)，提示當(dāng)前的早期診斷技術(shù)具有自身的局限性[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，利用陰性富集法對(duì)CTCs 進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肺癌CTCs 陽性率（84%）明顯高于肺良性疾病組（4%）[14]。 Ried 等[15]研究者使用ISET 技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在無癥狀但為高危因素人群中檢測(cè)到CTCs 的接近50%。這表明CTCs 對(duì)肺癌的早期診斷具有重要的價(jià)值。 季福慶等[16]對(duì)乳腺癌患者外周血中的CTCs 進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)CTCs 與乳腺癌患者腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移以及TNM 分期存在一定的相關(guān)性，對(duì)其臨床指導(dǎo)和預(yù)后具有指導(dǎo)意義，另外，Zhao 等人在體外分離擴(kuò)增培養(yǎng)CTCs, 建立了一株來源于乳腺癌晚期患者外周血中的CTCs 的細(xì)胞系,并命名為CT C-3[17]，目前對(duì)其單細(xì)胞測(cè)序進(jìn)行分析，旨在篩選出CTCs 特有的敏感性和特異性強(qiáng)的乳腺癌耐藥基因?yàn)閷ふ胰橄侔┰缙谠\斷提供科學(xué)依據(jù)。

3.2 腫瘤的分期及預(yù)后評(píng)估 CTCs 計(jì)數(shù)和表型的轉(zhuǎn)變能夠輔助腫瘤的定性及惡性程度的判斷，CTCs 計(jì)數(shù)越多提示病灶臨床分期可能越晚，可在一定程度上指導(dǎo)臨床決策。 對(duì)轉(zhuǎn)移腫瘤患者進(jìn)行預(yù)后評(píng)估是目前CTC 臨床應(yīng)用最廣泛的領(lǐng)域。 惡性腫瘤患者治療前后的CTC 類型和數(shù)目的變化具有重要的預(yù)后提示價(jià)值。 大量實(shí)驗(yàn)證明CTC 的出現(xiàn)與晚期癌癥患者的預(yù)后密切相關(guān)[18,19]。 CTC 檢測(cè)作為一種簡(jiǎn)單的血液檢測(cè)可隨時(shí)獲取用于評(píng)估患者的預(yù)后。

3.3 腫瘤的療效評(píng)價(jià)與用藥指導(dǎo) 抗腫瘤治療的療效監(jiān)測(cè)是CTCs 另一重要臨床應(yīng)用。 CTCs 檢測(cè)可作為影像學(xué)及臨床評(píng)分體系的補(bǔ)充,對(duì)患者的治療應(yīng)答作出評(píng)價(jià)。 如在藥物治療后1~2 周, 通過CTCs 的檢測(cè), 可觀察循環(huán)細(xì)胞類型和數(shù)量的改變預(yù)測(cè)治療效果。 CTCs 對(duì)化療療效評(píng)估已被多項(xiàng)研究證實(shí)[20,21]。 CTC 檢測(cè)不僅可提供預(yù)后預(yù)測(cè)、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和療效監(jiān)測(cè), 同時(shí)CTC 的分子分析還可以反映患者腫瘤的基因信息，指導(dǎo)個(gè)體化用藥。

4 展望

CTCs 攜帶了腫瘤細(xì)胞的遺傳和生物學(xué)信息，可為腫瘤轉(zhuǎn)移、進(jìn)展及化療敏感和耐藥性提供新的研究方向。 但目前對(duì)CTCs 的檢測(cè)技術(shù)仍不斷在完善,在世界范圍尚無一個(gè)測(cè)定與臨床應(yīng)用的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。 要實(shí)現(xiàn)CTCs 在腫瘤精準(zhǔn)診療中的應(yīng)用，未來可從CTCs 的富集、鑒定、計(jì)數(shù)到下游分析，利用納米芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)特異性的無損釋放富集到的CTCs[22], 并通過數(shù)字PCR 檢測(cè)技術(shù)和單細(xì)胞測(cè)序等技術(shù),比較CTCs 與原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶中基因組、轉(zhuǎn)錄組及表觀遺傳組的差異,為認(rèn)識(shí)腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的生物學(xué)機(jī)制提供新的視角。 相比通過腫瘤組織標(biāo)本鑒定基因組變化和基因表達(dá)改變的傳統(tǒng)模式,CTCs 攜帶的組學(xué)信息更具有研究意義,可準(zhǔn)確和全面的提供癌癥轉(zhuǎn)移機(jī)制和獲得性耐藥的腫瘤遺傳學(xué)改變的信息[23-25]。 其次可以通過體外培養(yǎng)擴(kuò)增腫瘤患者外周血中稀少的CTCs, 獲取足夠多的細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行基因、蛋白、功能等各個(gè)層面的分析對(duì)于腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療具有重要的臨床意義。 體外培養(yǎng)擴(kuò)增的CTCs 可用于構(gòu)建動(dòng)物模型、耐藥及藥物敏感性試驗(yàn)[26]等臨床前實(shí)驗(yàn)，并提高CTCs 表型分析的精度鑒別出真正導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的CTC 亞群的分子特征,進(jìn)而以之構(gòu)建轉(zhuǎn)移干預(yù)藥物的體外篩選平臺(tái)。 對(duì)于CTCs 的研究將有利于腫瘤患者早期診斷、輔助臨床進(jìn)行精確治療、術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移及預(yù)后評(píng)估。