Wnt/β-catenin 通路及uPA 在子宮內(nèi)膜癌中的作用機制研究

張玉洲，孫少霖，楊璇

（1.開封市婦產(chǎn)醫(yī)院婦科，河南 開封475000；2 開封市婦產(chǎn)醫(yī)院病理科，河南 開封475000）

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma，EC）是一種子宮內(nèi)膜上皮細胞惡性病變，EC 好發(fā)于圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后的女性,其發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)疾病中排名第三[1]。 Wingless/β-連環(huán)蛋白（Wnt/β-cate nin）通路參與調(diào)節(jié)細胞增殖、細胞存活、細胞遷移和侵襲等細胞行為,已經(jīng)有研究證實在EC 中Wnt/β-catenin 通路被過度激活可以促進腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[2]。 尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase type plasminogen activator，uPA)是一種絲氨酸蛋白酶,參與細胞外基質(zhì)纖維蛋白的溶解, 與腫瘤細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT） 以及腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3,4]。 有研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin 和uPA 的表達與EC 的病理學(xué)特征和預(yù)后有關(guān)， 但是關(guān)于Wnt/β-catenin 通路及uPA在EC 中的作用機制尚不明確[5]。 本文主要分析Wnt/β-catenin、uPA 在調(diào)節(jié)EC 細胞遷移和侵襲中的機制，報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和材料 人EC 細胞株KLE 購自北納生物（中國）。 DMEM 培養(yǎng)基以及胎牛血清購自Gibco（美國）。 KLE 細胞株來自一位68 歲的女性，是未分化的、II 型的子宮內(nèi)膜腺癌細胞株。 Wnt-1過表達和uPA 沉默質(zhì)粒由上海Genepharma 公司建造（中國）。 LipofectamineTM 2000（Invitrogen，美國）。CCK-8 試劑盒購自Dojindo（日本）。酶標儀型號ELX 800,公司為Bio-Teck（美國）。Trans-well 小室（Millipore,美國）。 Anti-Wnt-1（ab15251,41 kD）、anti-β-catenin （ab16051，94 kD）、anti-uPA（ab169 754，48 kD）、anti-β-actin （ab8226，42kD） 均來自Abcam 公司（美國）。Trizol（Invitrogen，美國）。Wnt-1、β-catenin、uPA、MMP-9、MMP2、N-cadherin 的定量PCR（quantitative PCR，qPCR）引物由北京三博遠志生物技術(shù)有限責(zé)任公司（中國）設(shè)計和合成。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa 和SYBR Prellix Ex TaqTM qPCR 試劑盒購自TaKaRa （日本）。 倒置顯微鏡（Olympus IX71，日本）

1.2 細胞分組和干預(yù)方法 將人EC 細胞KLE 在含有10%的胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5%的CO2。 將細胞分為5 組，即對照組、陰性對照組、Wnt-1 組、si-uPA 組和Wnt-1+siuPA 組,其中Wnt-1 組通過轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt-1 pcDNA 3.1質(zhì)粒上調(diào)Wnt-1 的水平；si-uPA 組通過轉(zhuǎn)染siuPA 質(zhì)粒敲低uPA 的水平。 Wnt-1+si-uPA 組共同轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt-1 pcDNA 3.1 以及si-uPA; 空質(zhì)粒被用于陰性對照組。 每組細胞在轉(zhuǎn)染48 h 后統(tǒng)一收集用于后續(xù)實驗。

1.3 檢測指標和方法

1.3.1 qPCR 檢測mRNA 使用qPCR 檢測各組細胞轉(zhuǎn)染后Wnt-1、uPA mRNA 的表達水平評估轉(zhuǎn)染效率。 并分析遷移、侵襲相關(guān)基因的表達水平。 細胞裂解后使用Trizol 收集總RNA,通過在95℃下激活DNA 聚合酶5 min 進行PCR，然后進行40 個循環(huán)的兩步PCR（95℃下10s 和60℃下30s），之后在75℃下延伸10min, 最后保持在4°C,β-actin 作為mRNA 的內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCT 法分析RNA 水平。

1.3.2 Western blot 檢測蛋白表達水平 通過Western blot 檢測各組細胞Wnt-1、β-catenin、uPA 蛋白的表達水平。 在液氮的保護下裂解細胞，12 000 rpm 離心15min 后收集上清液, 使用10%的SDSPAGE 凝膠用于電泳，電泳后使用PVDF 膜轉(zhuǎn)膜并在室溫下用5%無脂牛奶封閉2 h。 加入一抗室溫震蕩2 h，后在4℃孵育過夜，加入二抗。 使用βactin 作為內(nèi)參。

1.3.3 CCK-8 檢測細胞活力 CCK-8 法用于測定轉(zhuǎn)染后細胞活力。 將細胞接種于96 孔板，加入10 μl CCK-8 試劑并在37℃，5%的CO2中培養(yǎng)4 h。使用酶標儀測量每個孔在450nm 處的吸光度（OD）。

1.3.4 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移 使用細胞劃痕實驗檢測各組細胞的遷移能力。 細胞消化后收集，以每孔1:106的比例接種在6 孔板中，并用培養(yǎng)基在每個孔中培養(yǎng)至90%匯合。 通過200μl 移液管的尖端從上到下刮擦單層細胞。 然后用PBS 洗滌刮去的細胞。 之后并進一步培養(yǎng)24h。 在倒置顯微鏡捕獲單層圖像。 使用Image J 軟件評估兩側(cè)前緣之間的間隙。

1.3.5 Transwell 實驗檢測細胞侵襲 收集3×104個細胞并轉(zhuǎn)移到Transwell 小室的上室， 底室填充有10%FBS 的完全培養(yǎng)基。 孵育48h 后，用棉簽輕輕掃除未侵入膜的細胞。 然后用20%甲醇固定細胞并用0.2%結(jié)晶紫染色。 在倒置顯微鏡下計數(shù)每場侵入底室的細胞。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 所有實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準偏差(SD)表示。統(tǒng)計分析軟件為SPSS 19(SPSS，Inc.,Chicago,IL,USA)。 進行單因素方差分析（ANOVA）以評估實驗組之間的差異。Speaman 被應(yīng)用于檢測相關(guān)性分析。 P<0.05 為比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞Wnt-1、β-catenin、uPA mRNA 和蛋白水平比較 在轉(zhuǎn)染48 h 后, 分別使用qPCR 和Western blot 檢測Wnt-1、β-catenin、uPA mRNA 和蛋白水平,結(jié)果顯示W(wǎng)nt-1 組的Wnt-1、β-catenin、uPA 水平均顯著高于對照組和陰性對照組，說明轉(zhuǎn)染實驗成功，并且Wnt-1 的水平會影響uPA mRNA 和蛋白的表達。 si-uPA 組的Wnt-1、β-catenin表達水平變化不顯著, 而uPA mRNA 和蛋白的水平顯著降低，說明si-uPA 轉(zhuǎn)染成功，并且si-uPA對Wnt-1、β-catenin 水平無顯著影響。 此外，Wnt-1+si-uPA 組的Wnt-1 和β-catenin 也無顯著變化且uPA mRNA 和蛋白水平顯著低于Wnt-1 組，說明si-uPA 可以逆轉(zhuǎn)Wnt-1 促進uPA 表達的作用，進一步說明uPA 的表達水平被Wnt-1 和βcatenin 調(diào)控，見表1、表2 和圖1。

表1 轉(zhuǎn)染后各組細胞Wnt-1、β-catenin、uPA mRNA 水平比較

表2 轉(zhuǎn)染后各組細胞Wnt-1、β-catenin、uPA 蛋白水平比較

2.2 各組細胞活力比較 轉(zhuǎn)染后使用CCK-8 法檢測細胞活力，結(jié)果顯示在培養(yǎng)48 h 后，Wnt-1 組細胞活力升高而si-uPA 組細胞活力降低，并且Wnt-1+si-uPA 組細胞活力顯著低于Wnt-1 組，說明siuPA 可部分逆轉(zhuǎn)Wnt-1 過表達促進細胞活力的作用，見表3。

2.3 各組細胞遷移和侵襲能力比較 分別使用細胞劃痕實驗和Transwell 實驗分析各組細胞轉(zhuǎn)染后的遷移和侵襲能力,結(jié)果顯示在培養(yǎng)48 h 后，Wnt-1 組細胞遷移和侵襲率升高而si-uPA 組降低，并且Wnt-1+si-uPA 組細胞遷移和侵襲率顯著低于Wnt-1 組，說明si-uPA 可部分逆轉(zhuǎn)Wnt-1 過表達促進細胞遷移和侵襲的作用，見表4。

圖1 Western blot 檢測各組細胞中Wnt-1、β-catenin、uPA 蛋白水平

表3 各組細胞活力比較

表4 各組細胞遷移和侵襲能力比較

2.4 各組遷移侵襲相關(guān)基因表達水平比較 通過檢測各組遷移、侵襲相關(guān)基因的表達水平發(fā)現(xiàn),Wnt-1 組MMP2、MMP9、N-cadherin mRNA 水 平 升 高而si-uPA 組降低,并且Wnt-1+si-uPA 組MMP2、M MP9、N-cadherin mRNA 水平顯著低于Wnt-1 組，說明si-uPA 可部分逆轉(zhuǎn)Wnt-1 過表達促進細胞MMP2、MMP9、N-cadherin mRNA 表 達 水 平 的 作用，見表5。

表5 各組遷移侵襲相關(guān)基因表達水平比較

3 討論

調(diào)查顯示EC 的發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)均呈現(xiàn)上升趨勢, 中國女性子宮內(nèi)膜癌病例在過去10年中有所增加。 根據(jù)臨床特征和發(fā)病機制，子宮內(nèi)膜癌可分為兩類，I 型子宮內(nèi)膜癌通常發(fā)生在圍絕經(jīng)期婦女中, 與肥胖和雌激素暴露有關(guān)；II 型子宮內(nèi)膜癌在老年女性中更常見，預(yù)后比I 型更差[6]。手術(shù)切除和放療是治療EC 的最常用、有效的手段,然而仍有患者存在復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移影響預(yù)后, 研究認為EC 的遠端轉(zhuǎn)移以及淋巴轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的主要因素, 因此探究EC 的發(fā)病機制可為治療EC提供新思路[7]。

EMT 是指上皮細胞獲得間充質(zhì)細胞的運動和侵襲特征,是腫瘤侵襲-轉(zhuǎn)移級聯(lián)中的重要過程，其中上皮細胞層失去極性以及細胞-細胞粘附，是影響腫瘤預(yù)后的危險因素之一[8]。 uPA 可將纖溶酶原水解轉(zhuǎn)化為活性形式,從而參與基底膜和細胞外基質(zhì)的降解，并且uPA 對基本細胞過程有影響，包括趨化性，遷移，侵襲，粘附，增殖和血管生成[9]。 此外，EMT 涉及多種信號通路，包括核因子-κB 相關(guān)通路、Notch 通路、Ras 以及Wnt/β-catenin 等，在Wnt/β-catenin 通路中，Wnt 會避免β-catenin 被降解并促進β-catenin 在細胞質(zhì)中積累，β-catenin 被激活后進入細胞核調(diào)節(jié)基因的表達[10，11]。 本次研究使用人EC 細胞作為研究對象，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達Wnt-1 或敲低uPA，通過qPCR 以及Western blot 方法檢測Wnt-1、β-catenin 通路以及uPA mRNA 和蛋白的表達水平。結(jié)果顯示過表達Wnt-1可以促進β-catenin 和uPA 的表達水平，而si-uPA不會影響Wnt-1、β-catenin 表達, 但si-uPA 會逆轉(zhuǎn)Wnt-1 促進uPA 表達的總用, 這不但說明了轉(zhuǎn)染實驗成功,也提示在EC 中,uPA 對Wnt/β-catenin通路影響不顯著，而Wnt/β-catenin 通路可調(diào)節(jié)u-PA 的表達從而調(diào)節(jié)EC 細胞的生物學(xué)行為。 過往也有研究顯示在眼角膜上皮細胞中,Wnt/β-catenin通路會促進uPA 的水平[12]。 Asuthkar 等[13]的研究也發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin 通路具有調(diào)節(jié)uPA 水平的特點。 這說明在EC 中，Wnt/β-catenin 通路可以調(diào)節(jié)uPA 水平。

為進一步分析Wnt/β-catenin 通過uPA 對EC細胞行為的影響,我們分別用細胞劃痕實驗和Transwell 實驗檢測Wnt/β-catenin 和uPA 對遷移和侵襲的影響,結(jié)果顯示W(wǎng)nt-1 組細胞活力、細胞遷移和侵襲能力升高而si-uPA 組降低,并且Wnt-1+siuPA 組細胞活力、 細胞遷移和侵襲能力顯著低于Wnt-1 組，這說明si-uPA 可部分逆轉(zhuǎn)Wnt-1 過表達促進細胞活力、細胞遷移和侵襲能力的作用。 此外, 進一步的研究發(fā)現(xiàn)si-uPA 可部分逆轉(zhuǎn)Wnt-1過表達促進細胞MMP2、MMP9、N-cadherin mRNA表達水平。MMP2、MMP9 的過表達可以促進細胞外基質(zhì)的講解提高細胞遷移能力,而N-cadherin 的升高會促進細胞的遷移和侵襲能力,與EC 的預(yù)后有關(guān)[14，15]。 Liu 等[16]研究顯示在缺氧情況下,胃癌細胞中的Wnt/β-catenin 通路被激活，并可能通過促進uPA 和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達促進胃癌細胞的遷移和侵襲。Tao 等[17]的研究顯示W(wǎng)nt/β-catenin 通路的上調(diào)會促進MMP2、MMP9 以及N-cadherin 的表達促進細胞的遷移和侵襲。 已經(jīng)有臨床研究顯示高水平的uPA 預(yù)示著更差的EC 分期和更高風(fēng)險的轉(zhuǎn)移[18]。 Ghasemi 等[19]的研究顯示uPA 的過表達會促進細胞的遷移和侵襲。

綜上所述,在EC 細胞中,Wnt/β-catenin 的過表達會通過促進uPA 的表達促進EC 的遷移和侵襲，這可能成為治療EC 的新思路。 但是關(guān)于Wnt/βcatenin 通過調(diào)節(jié)uPA 并參與EMT 的機制還需要進一步研究。