造血干細(xì)胞治療心肌梗死的機(jī)制研究進(jìn)展

姜浩東 ，麥明杰 ，趙明一 ，陳瑞平 ，吳楚漫 ，朱 平

［1.廣東省心血管病研究所廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），廣州510100；2.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣州 511400；3.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院，長(zhǎng)沙410006；4.中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，廣州510700］

提要：造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs）獲取相對(duì)容易，應(yīng)用時(shí)無(wú)組織相容性問(wèn)題及倫理爭(zhēng)議，在再生醫(yī)學(xué)的研究及應(yīng)用中具有較大的潛力。研究證明，HSCs 具有促進(jìn)心肌損傷后修復(fù)，改善受損心臟功能的作用。心肌梗死后多種細(xì)胞因子等生物活性分子及相關(guān)信號(hào)通路參與HSCs動(dòng)員、歸巢至心臟。同時(shí)，研究表明多種機(jī)制可能促進(jìn)HSCs 發(fā)揮心肌修復(fù)作用，如轉(zhuǎn)分化、細(xì)胞融合、旁分泌、促進(jìn)心外膜細(xì)胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等，但其確切機(jī)制尚有爭(zhēng)議。本文就近年來(lái)關(guān)于HSCs 在心肌梗死后動(dòng)員及發(fā)揮修復(fù)作用的機(jī)制研究進(jìn)展作全面概述。

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）是我國(guó)居民疾病死亡首位原因，約占40%［1］以上。心肌梗死（myocardial infarction，MI）是 CVD 中最危急重的病癥之一，MI 后心肌細(xì)胞數(shù)量的減少以及心臟瘢痕組織的增生使心臟收縮能力下降，最終導(dǎo)致心力衰竭。目前的治療手段如溶栓、冠狀動(dòng)脈（冠脈）旁路移植術(shù)、介入治療等都只能挽救瀕臨壞死的心肌，而對(duì)已壞死的心肌作用甚微。由于供體稀缺、免疫排斥等局限性，心臟移植（heart transplantation，HT）無(wú)法成為臨床常規(guī)治療措施。利用干細(xì)胞進(jìn)行心血管修復(fù)為臨床治療MI 提供了新的思路，多種干細(xì)胞被證明在MI 方面具有治療潛能［2-3］。

造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs）傳統(tǒng)定義為多潛能性干細(xì)胞，是一個(gè)異質(zhì)性的群體，具有長(zhǎng)期自我更新的能力和分化成各類成熟血細(xì)胞的潛能，是所有血細(xì)胞和免疫細(xì)胞的始祖。早期對(duì)HSCs 的研究主要集中在移植及治療血液病方面，目前這種方法廣泛用于惡性、難治性血液病及遺傳性疾病和某些實(shí)體瘤的治療。但最近研究發(fā)現(xiàn)，HSCs 除能夠分化出所有種類的血細(xì)胞外還能分化為多種非造血譜系細(xì)胞如骨骼肌細(xì)胞［4］、肝臟細(xì)胞［5］、神經(jīng)元［6］、心肌細(xì)胞［7］等。此外，HSCs 獲取相對(duì)容易，應(yīng)用時(shí)無(wú)組織相容性及倫理爭(zhēng)議，是極具潛力的治療心肌梗死的“種子”細(xì)胞來(lái)源。

1 心肌梗死后造血干細(xì)胞的動(dòng)員機(jī)制

1.1 趨化因子作用

MI 涉及心肌細(xì)胞壞死、炎癥以及瘢痕形成，壞死過(guò)程伴隨大量細(xì)胞因子等生物活性分子釋放。HSCs 歸巢是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及HSCs 動(dòng)員、黏附、遷移及定植到缺血心肌部位。整個(gè)過(guò)程受各種細(xì)胞因子、骨髓微環(huán)境等相互作用的影響。趨化因子是一類具有化學(xué)引誘物作用的細(xì)胞因子，可被分為四個(gè)亞家族：CXC（或α-趨化因子），CC（或β-趨化因子），CX3C 和XC，趨化因子家族與G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合后具有介導(dǎo)趨化和細(xì)胞歸巢的共性［7］。CCL2 是CC亞家族的成員之一，主要與多種細(xì)胞表面表達(dá)的CCR2R 結(jié)合。MI后血漿CCL2濃度升高，是充血性心力衰竭重要的促炎因子，而心肌細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)CCL2 則可以抑制其促炎作用且對(duì)MI后心肌細(xì)胞有保護(hù)作用［8］。CXCL2 是CXC亞家族成員，與CCL2 類似，CXCL2 也同樣具有雙重作用，CXCL2 和CCL2 都被認(rèn)為可以在缺血損傷早期募集中性粒細(xì)胞，但同時(shí)心肌細(xì)胞過(guò)表達(dá)后可以對(duì)心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。因此未來(lái)的研究要注重如何在避免心肌損傷的情況下最有效地利用若干趨化因子的心肌保護(hù)作用。CXCL12 是HSCs 動(dòng)員過(guò)程中重要的信號(hào)因子。骨髓中的CXCL12與CXCR4結(jié)合可以促使HSCs潴留在骨髓干細(xì)胞微環(huán)境中，骨髓CXCL12 的濃度的降低可促使HSCs被趨化至外周血。而MI 后局部CXCL12 的分泌增加同樣會(huì)促使骨髓HSCs動(dòng)員至外周血中［9］。

動(dòng)物模型表示CXCL12 可以增強(qiáng)MI 小鼠心室功能、改善MI 區(qū)域周邊毛細(xì)血管密度［10］。另外有報(bào)道稱CXCR4 的拮抗劑如AMD3100 能夠在缺血再灌注損傷后改善心功能恢復(fù)，根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，AMD3100可以通過(guò)破壞骨髓中的CXCL12 與CXCR4 的結(jié)合，來(lái)促使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物缺血再灌注損傷后第 1 天增加 CXCR4 陽(yáng)性細(xì)胞的動(dòng)員［11］。而 G-CSF、AMD3100 等可以上調(diào)骨髓細(xì)胞中的幾種蛋白水解酶如基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）-2、MMP-9、組織蛋白酶G、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶等，它們可以水解切割滅活SDF-1 和CXCR4，來(lái)解除其“錨定”的作用。另外AMD3100 可能通過(guò)增加動(dòng)員至外周的骨髓干細(xì)胞中的內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的合成來(lái)實(shí)現(xiàn)心功能的保護(hù)作用。內(nèi)皮型一氧化氮合酶是內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移，血管重建和血管生成的重要因子［12］，在缺血早期，內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)增加可以一定程度促進(jìn)血管生成而增加毛細(xì)血管密度、抑制心肌凋亡。

1.2 其他細(xì)胞因子作用

除了CXCL12 和CXCR4 相互作用以外，還有其他細(xì)胞因子及相關(guān)的信號(hào)通路作用于整個(gè)HSCs 動(dòng)員、歸巢至心臟的過(guò)程［13-14］。如 Wnt 信號(hào)通路，Assmus 等［15］表示 MI 誘導(dǎo)了典型Wnt 信號(hào)的激活，與HSCs 的擴(kuò)展和遷移有關(guān)。Wnt 通路是復(fù)雜的信號(hào)蛋白家族，經(jīng)典和非經(jīng)典的啟動(dòng)途徑受組織微環(huán)境中的大量細(xì)胞因子和小分子的影響。非經(jīng)典Wnt 途徑的激活可以在經(jīng)典信號(hào)中發(fā)揮抑制作用。急性MI后骨髓內(nèi)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制尚不清楚，有學(xué)者推測(cè)是由于兒茶酚胺的激活導(dǎo)致的［15］。

此外，生物活性脂質(zhì)鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）和神經(jīng)酰胺-1-磷酸（ceramide-1-phosphate，C1P），已在外周血中被鑒定為主要的HSCs 化學(xué)引誘物［16-17］，其中S1P 主要通過(guò)紅細(xì)胞在外周血中轉(zhuǎn)運(yùn)，缺血性心肌損傷后先天性免疫系統(tǒng)的激活和全身補(bǔ)體的激活可以促使紅細(xì)胞釋放生物活性脂類物質(zhì)，血漿C1P的主要來(lái)源是細(xì)胞內(nèi)C1P 釋放或從受損細(xì)胞中泄漏［18］。到目前為止，研究人員已經(jīng)鑒定出了S1P（S1P1-5）的5 種受體亞型，S1P1-3 在整個(gè)心血管系統(tǒng)和骨髓前體細(xì)胞中高度表達(dá)。S1P1 作用由 Gi 蛋白、Ras-MAP 激酶、PI3K-AKt、PLC 途徑介導(dǎo)。而S1P2和S1P3受體作用由PLC 途徑和Rho途徑通過(guò)多種G 蛋白介導(dǎo)。S1P 與S1P1 或S1P3 結(jié)合來(lái)介導(dǎo)造血前體細(xì)胞的遷移。相反，激活S1P2 則產(chǎn)生負(fù)調(diào)節(jié)HSCs 動(dòng)員的作用。S1P4 和S1P5 受體分別在免疫和神經(jīng)系統(tǒng)中起作用。C1P 同樣可以與多種G 蛋白偶聯(lián)受體相互作用［18］。心臟神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)骨髓來(lái)源前體細(xì)胞動(dòng)員至心臟［19］。溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）處理過(guò)的臍帶血來(lái)源CD34+細(xì)胞可以增強(qiáng)其在缺氧條件下的生存能力［20］，LPA 主要通過(guò)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ 誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞存活，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ的激活可誘導(dǎo)Akt 和ERK 信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活和抑制線粒體凋亡途徑（降低BAX 和CASP9的表達(dá)）。

1.3 心肌損傷是造血干細(xì)胞動(dòng)員的重要前提

人體內(nèi)大多數(shù)HSCs 處于靜止?fàn)顟B(tài)，可以在諸如感染等系統(tǒng)性損傷的情況下激活。HSCs 對(duì)組織損傷的反應(yīng)可能與缺血性損傷中患者的長(zhǎng)期存活率相關(guān)，且HSCs 在組織修復(fù)和患者康復(fù)中起一定作用［21-24］。有研究顯示，急性MI 后CD34+、CD133+細(xì)胞水平顯著增加，在缺血性損傷后7 d 達(dá)到頂峰，CD34+細(xì)胞的初始動(dòng)員程度已被證明是急性MI 后更有利于心肌重構(gòu)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。此外，急性MI后升高的多種細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）或粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF），可調(diào)節(jié)造血祖細(xì)胞（hematopoietic progenitor cells，HPC）的增殖［25］。Theiss 等［26］測(cè)量了缺血型心肌?。↖CM），擴(kuò)張型心肌病（DCM）和正常人的心肌中歸巢因子的mRNA 表達(dá)水平，與擴(kuò)張型心肌病和對(duì)照心臟相比，缺血型心肌病心臟中CXCL12、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、缺氧誘導(dǎo)因子-1a 和血管細(xì)胞黏附分子顯著升高（擴(kuò)張型心肌病和對(duì)照心臟顯示相似的表達(dá)）。心肌缺血后，各種趨化因子表達(dá)增加，可以進(jìn)一步促進(jìn)從骨髓中動(dòng)員出的干細(xì)胞歸巢心臟。心肌損傷后膜聯(lián)蛋白-A1（ANX-A1）的表達(dá)也會(huì)增加，膜聯(lián)蛋白-A1（ANX-A1）是一種糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白5，具有抗炎作用，可以保護(hù)心肌免受缺血性損傷、減少梗死面積，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白-A1的缺乏會(huì)增加心肌缺血后小鼠梗死面積增加，心肌炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，與之伴隨的是HSCs 的動(dòng)員增加［27］。

此外，miRNA 是最近研究的熱點(diǎn)，部分miRNA 具有組織特異性表達(dá)的特點(diǎn)，如心肌組織中富含miR-208a 和miR-499-5p，而miR-1a 和miR-133a 則在心肌和骨骼肌中均存在高表達(dá)。有研究證明，MI 后外周血內(nèi)心肌特異性miRNA（miR-1、miR-208、miR-499）會(huì)顯著增高，這些外周循環(huán)內(nèi)的心肌特異性miRNA 大多存在于外泌體內(nèi)被釋放入血［28］。這些包裹心肌特異性miRNA 的外泌體選擇性地遷移至其他組織，且優(yōu)先轉(zhuǎn)移到骨髓，在骨髓中它們抑制CXCR4 的表達(dá)并介導(dǎo)骨髓細(xì)胞的動(dòng)員。

2 造血干細(xì)胞應(yīng)用于心肌梗死的機(jī)制研究進(jìn)展

近些年相繼有臨床實(shí)驗(yàn)使用HSCs 用于治療MI［29-31］。由此引出對(duì)HSCs 對(duì)應(yīng)用于MI 的機(jī)制探討。

2.1 轉(zhuǎn)分化機(jī)制

有學(xué)者認(rèn)為，HSCs 動(dòng)員至心臟后可以轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞。骨髓來(lái)源干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞是心肌細(xì)胞再生研究的重要方向，應(yīng)用于心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究的骨髓來(lái)源細(xì)胞主要包括兩大類：即HSCs 和間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC），有研究［32-34］證明，HSCs 和 MSCs 都能獲得心肌細(xì)胞表型，其中Fukata 等［34］的研究檢測(cè)了骨髓細(xì)胞在同基因骨髓移植后的心肌形成潛力，以鑒定具有心肌潛能的骨髓來(lái)源細(xì)胞群，骨髓來(lái)源的心肌細(xì)胞來(lái)源于造血譜系，而其中髓系細(xì)胞則是產(chǎn)生心肌細(xì)胞的主要中間體。2001 年Orlic 等將骨髓提取的骨髓單個(gè)核細(xì)胞注射到結(jié)扎了冠狀動(dòng)脈前降支的小鼠MI 心肌區(qū)域內(nèi)，發(fā)現(xiàn)9 d 后其MI 區(qū)域心肌收縮功能改善，因此認(rèn)為是移植的干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成了心肌細(xì)胞，而對(duì)于HSCs［14］獲得心肌細(xì)胞表型的機(jī)制，上述研究尚無(wú)定論。因此對(duì)于對(duì)移植HSCs 能否轉(zhuǎn)化心肌細(xì)胞的問(wèn)題上，應(yīng)該保持謹(jǐn)慎態(tài)度。

2.2 細(xì)胞融合機(jī)制

部分學(xué)者認(rèn)為HSCs 動(dòng)員至心臟后發(fā)揮作用的主要機(jī)制是產(chǎn)生了細(xì)胞融合的現(xiàn)象。2004 年Balsal 等［35］表明在表達(dá)綠色熒光蛋白（green flfluorescent protein，GFP）的轉(zhuǎn)基因鼠的MI 部位直接注射Ckit+骨髓細(xì)胞后并沒(méi)有觀察到Orlic 所提到的轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象，雖然移植后10 d 可以在心肌中觀察到大量GFP+細(xì)胞，但在30 d 后只有少量的GFP+細(xì)胞仍然存留在心肌。而且GFP+細(xì)胞沒(méi)有表達(dá)特異心臟標(biāo)記物，而表達(dá)CD45、髓系標(biāo)志物Gr-1、淋巴系標(biāo)志物B220 等造血系統(tǒng)標(biāo)志物。之后Wu［36］等的研究提出Balsam等的數(shù)據(jù)一定程度低估了心肌受損后循環(huán)細(xì)胞的作用，因?yàn)槠洳](méi)有考慮到MI 后建立穩(wěn)定的共生模型所需時(shí)間的因素。若交叉循環(huán)建立的穩(wěn)定少于7 d，那么在MI 小鼠的心臟處骨髓來(lái)源細(xì)胞的聚集就不夠充分，下一步的轉(zhuǎn)化過(guò)程就無(wú)法順利進(jìn)行。考慮到損傷誘導(dǎo)信號(hào)是干細(xì)胞活動(dòng)的重要調(diào)節(jié)因子，只有在損傷早期才會(huì)短暫升高，如免疫調(diào)節(jié)劑和趨化因子，Wu 的研究較前者不同之處在于小鼠共生模型交叉循環(huán)穩(wěn)定后（大約7～10 d）再進(jìn)行手術(shù)誘導(dǎo)MI，從而重新評(píng)估循環(huán)細(xì)胞的作用。兩周后進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)少部分GFP+細(xì)胞分別表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物：異凝集素（isolectin）和SM22α，表明循環(huán)細(xì)胞參與了微血管的重建。大部分不表達(dá)平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物的循環(huán)細(xì)胞大都表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志物CD45，包括T 系（21.25%±0.05%），B系（39.25%±2.35%），巨噬細(xì)胞系（29.9%±1.90%）。此外將MerCreMer（MCM）轉(zhuǎn)染小鼠與GFP 轉(zhuǎn)染小鼠做同樣處理并在MI 部位取樣做免疫組化分析發(fā)現(xiàn)GFP+細(xì)胞分散在缺血區(qū)域，部分細(xì)胞表達(dá)了成熟心肌細(xì)胞標(biāo)志物肌鈣蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）。定量分析顯示缺血區(qū)域GFP 陽(yáng)性細(xì)胞中有9.39%的細(xì)胞同時(shí)表達(dá)Cre（GFP+/Cre+），表明循環(huán)GFP+細(xì)胞與原有心肌細(xì)胞發(fā)生了融合。同時(shí)（GFP+/Cre-）類型細(xì)胞占0.17%，提示循環(huán)細(xì)胞發(fā)生了轉(zhuǎn)分化，但比例較低。上述結(jié)果表明細(xì)胞融合相對(duì)轉(zhuǎn)分化是較為主要的機(jī)制。心肌細(xì)胞是終末分化的細(xì)胞，具有非常有限的增殖能力。細(xì)胞融合可以促進(jìn)心肌細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期［37］，因此，細(xì)胞融合在心肌細(xì)胞修復(fù)中具有潛在的優(yōu)勢(shì)。

2.3 旁分泌機(jī)制

對(duì)于轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞融合發(fā)揮的作用，越來(lái)越多人保持懷疑態(tài)度，因?yàn)榇罅窟M(jìn)入心臟的細(xì)胞并不能長(zhǎng)期存留。目前學(xué)者開(kāi)始關(guān)注HSCs 動(dòng)員至心臟后通過(guò)其旁分泌作用發(fā)揮功能。

有研究表明，移植SCs 的研究沒(méi)有表現(xiàn)出永久的移植細(xì)胞的定植，但仍然有心功能的改善，且MSCs 的條件培養(yǎng)基具有心臟保護(hù)作用，胞外囊泡可能在MSCs 發(fā)揮旁分泌效能中起關(guān)鍵作用［38］。HSCs 亦有相似發(fā)現(xiàn)。胞外囊泡包括外泌體（30～100 nm），微泡（100～1 000 nm）和凋亡小體（高達(dá)5 000 nm）。MI 后心肌細(xì)胞釋放入血的胞外囊泡如外泌體是MI 診斷的潛在標(biāo)志物，此外，制作包含缺血心肌靶向肽（如IMTP）的胞外囊泡作為細(xì)胞治療及藥物治療的載體在MI 的治療中具有很大潛力［39-40］。胞外囊泡中包含有多種具有催化活性的蛋白質(zhì)以及在細(xì)胞間信息傳遞起重要作用的 mRNA 和 miRNA［41］。HSCs 主要產(chǎn)生外泌體和微泡兩種，已發(fā)現(xiàn)HSCs 分泌的外泌體表達(dá)幾種抗細(xì)胞凋亡和促血管生成因子的mRNA，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），胰島素生長(zhǎng)因子-1，堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子，和白細(xì)胞介素-8［42］。有研究表明，GSF動(dòng)員的骨髓來(lái)源的外泌體含有豐富的microRNA-126（miR-126）能降低血管黏附因子-1（VCAM-1）的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)HSCs 從骨髓到外周血的動(dòng)員。而microRNA-126不僅可以作為細(xì)胞功能的內(nèi)在調(diào)節(jié)因子，還能作為促進(jìn)血管形成的旁分泌因子起作用［43］。

2.4 其他可能機(jī)制

除上述可能機(jī)制以外，有學(xué)者認(rèn)為HSCs 可能促進(jìn)心外膜細(xì)胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化從而實(shí)現(xiàn)MI 后對(duì)心臟的保護(hù)作用。在心臟發(fā)育過(guò)程中，胎兒心外膜可分泌促進(jìn)心肌生長(zhǎng)的因子，心外膜細(xì)胞的一個(gè)亞群也經(jīng)歷上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換，形成心外膜衍生細(xì)胞（EPDCs）。心外膜衍生細(xì)胞被認(rèn)為可在心臟正常發(fā)育過(guò)程中分化形成心肌和內(nèi)皮細(xì)胞，但這一理論仍存在爭(zhēng)議［44］。

Li 等［45］將幼年小鼠Sca-1 陽(yáng)性（HSC 標(biāo)志）細(xì)胞移植入大齡小鼠體內(nèi)后，可在MI 后發(fā)揮保護(hù)心臟功能的作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，小鼠Sca-1 陽(yáng)性細(xì)胞可在MI 后向心外膜歸巢并促使心外膜細(xì)胞增殖，并通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)通路激活上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化［45］。

3 問(wèn)題和展望

HSCs 應(yīng)用于MI 的機(jī)制研究說(shuō)法不一，但自體HSCs 用于治療MI 可以避免免疫排斥反應(yīng)，因此具有很大的應(yīng)用前景，但仍然存在一些問(wèn)題，如：（1）細(xì)胞移植治療的最佳細(xì)胞數(shù)量和濃度、移植方式、移植存活分化的機(jī)制；（2）細(xì)胞移植的遠(yuǎn)期療效及安全性；（3）是否有產(chǎn)生惡性心律失常及惡性腫瘤的可能，是否可能有系統(tǒng)并發(fā)癥；（4）如何提高HSCs 獲取率，完善HSCs 的純化與擴(kuò)增培養(yǎng)體系［20］。